Name: two-step approach to explore early- and late-stages of organ formation in the avian model: the thymus and parathyroid glands organogenesis paradigm
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm at JoVE.co

Yazarlar António Cidadão, Isabel Alcobia ve Leonor Parreira Padma Akkapeddi video anlatım için için el yazması eleştirel okuma için minnettarız ve Instituto de Histologia e Histoloji hizmetinden Vitor Proa için Biologia yapın Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz - Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Bu deneylerin hayvan bakımı ve Centro Académico de Medicina de etik kuralları izleyin Lisboa.
1. döllenmiş bıldırcın ve tavuk yumurtası kuluçka
<ol><li>Japon bıldırcın (Coturnix coturnix japonica) ve tavuk (Gallus gallus) döllenmiş yumurta 3 ve 8 gün boyunca sırasıyla kuluçkaya.<ol>
<li>Hava yukarı bakacak şekilde 38 ° C'de oksijen bir kuluçka odası (yumurta künt son) ile yumurta yer</li>
		<li>Yaklaşık 20 bıldırcın yumurtası ve 40 tavuk yumurtası bu deney yapmak için kullanın. Not: Bu rakamlar bu yordamı ilk kez kurarken iki katına.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. izolasyon timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren bıldırcın embriyonik bölgesi
Not: yumurta gerçekleştirmek işleme yordamları steril koşullarda yatay laminar akış kukuIeta ve sterilize edilmiş aletler ve malzemeler kullanarak.
<ol><li>Hakkında büyük borosilikat cam kase hazırlamak 3/4 soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm ile dolu.</li>
	<li>Bıldırcın yumurta kabuğu dokunarak ve dairesel bir açılış künt sonuna karşı tarafta eğri makasla kesme kuluçka 3 gün sonra açın. Dikkatle ve soğuk PBS ile dolu cam kase için embriyo transfer kabuk parçaları çıkarın.</li>
	<li>Bıldırcın (q) embriyo E3'te tutun (qE3) (HH-sahne alanı'na 21 tavuk karşılık gelen bıldırcın sahne) ince forseps yardımıyla. Bir kesim eğri makas kullanarak sarısı Zarflama vitelline membran olun. Çevresinde ve harici ekstra embriyonik damarları çevresi kesmeye devam.</li>
	<li>Transfer embriyo için küçük bir kase yaklaşık 3/4 ince forseps yardımıyla soğuk PBS ile dolu. Embriyo üzerinden kalan ekli sarısı iyice yıkayın.</li>
	<li>100 mm cam Petri kabına siyah temel ile embriyo transfer için bir kepçe kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 10 mL soğuk PBS içeren.</li>
	<li>Bir stereomicroscope altında Petri kabına yerleştirin. Not: Şu andan itibaren ilerici büyütme için bir stereomicroscope altında mikrocerrahi yordamları gerçekleştirin. Bir ışık kaynağı olarak LED ışıklar sınırlı ısı yükü dikkate alınarak stereomicroscope veya optik lifler dahil kullanmak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Embriyo alt kısmında ince böcek pimleri ile plaka için basılı tutun. Ekstra embriyonik bölgesinde bir kare şekli oluşturan dört iğne yerleştirin.</li>
	<li>Sefalik bölge ekstra embriyonik zarı ince forseps yardımıyla çıkarın ve beşinci bir PIN oraya yerleştirin. Not: embriyo doğru konumlandırdıysanız, sonra ve vezikül, kalbini tüp ve 1st, 2ndve 3rd faringeal kemerler (PAs) görünür olmalıdır.</li>
	<li>Wecker göz makas kullanarak embriyonik bölgenin ilgi, yani,rd 3 ve 4th faringeal kemer bölgesi (3/4PAR), incelemek.<ol>
<li>Somite/nöral tüp ve PAs arasındaki embriyo eksenine boyuna ve paralel kesme başlatın.</li>
		<li>Ventrally konumlandırılmış kalbini tüp kesim tarafından kaldırın. Makas aynı konumda tutmak, Petri kabına embriyo kesme yönüne göre yeniden konumlandırmak için döndürün.</li>
		<li>2nd ve 3rd PAs arasında ve 4th PA aşağıda kesmek</li>
		<li>3/4PAR ince forseps yardımıyla üzerinden kalan membranlar bağlantısını kesin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İzole doku (3/4PAR) ve onlara bir cam tabak 3/4 2 mL steril plastik pipet kullanarak soğuk PBS ile dolu transfer Aspire edin. Not: Bundan sonra dokular yetişkin vitro -ebilmek var olmak ilâ 48 s veya hemen bir tavuk embriyo E8, CAM üzerine aşılı.</li>
	<li>İzole 3/4PAR buzda vitro tahlil hazırlanması sırasında içeren cam çanak tutmak.</li>
</ol>3. Vitro Organotypic tahlil: timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren embriyonik bölgesinin kültürü
<ol><li>RPMI-%1640 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş orta ile kültür ortamı hazırlamak. Not:-Ebilmek üstelemek çözünür farmakolojik reaktifler ortamına (örneğin, LY-411.575 (Ly) ve di-benzazepine veya cyclopamine ve vismodegib, çentik ve yollar, sırasıyla sinyal Kirpi (Hh) inhibe. Bu tahlil 4PAR. cyclopamine 20 µM veya kullanın vismodegib 10 µM Hh 3/4PAR5' te sinyal etkisizleştirmek için / Ly 50-200 nM veya Di-benzazepine 5-15 µM çentik 3'te sinyal etkisizleştirmek için kullanın.</li>
	<li>3/4PP explant 6-şey plaka vitro kültürü hazırlayın.<ol>
<li>6-şey plaka bir kuyudan kültür orta 5 mL ile doldurulması. 24 mm Polikarbonat membran Ekle yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) üzerine ince forseps yardımıyla iyi.</li>
		<li>Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran yüzeyine bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile nazikçe kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Yedi explants membran Ekle başına ekleyin. 3.4 adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, kültür membran filtreleri yüzen explants.<ol>
<li>35 mm ile 5 mL kültür ortamının Petri kabına hazırlayın. İnce forseps, bir membran ( Tablo malzemelerigörmek) filtre ve hava ile temas halinde bir kuru yüzey tutun kayan nokta yardımıyla.</li>
		<li>Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran filtre için nazik bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Membran filtre başına 8 adete kadar explants ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dikkatlice adımları 3.2 ve %3.3 5 CO237 ° C'de oksijen bir kuluçka hazırlanan explants koyun.</li>
	<li>48 h kuluçka süresinden sonra 6-şey plaka ve 35 mm Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.<ol>
<li>Kültürlü explants gelen 6-şey plaka membran Ekle toplamak.<ol>
<li>PBS oda sıcaklığında (RT) membran Ekle'nin üzerine ekleyin.</li>
			<li>Explants membran gelen güçlü bir 2 mL steril plastik pipet kullanarak temizlenerek bağlantısını kesin.</li>
			<li>Spatula ve ince forseps yardımıyla, kültürlü explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak 3/4 için transfer</li>
		</ol>
</li>
		<li>Benzer şekilde, kültürlü explants 35 mm Petri kabına kayan membran filtre toplamak.<ol>
<li>Membran filtre yeni 35 mm Petri kabına PBS RT., dolu ince forseps ile aktarmak</li>
			<li>Explants membran filtre üzerinden dinç pipetting 2 mL steril plastik pipet kullanarak bağlantısını kesin.</li>
			<li>Hiçbir explants kaldı teyit ona bağlı sonra ince forseps yardımıyla, explant-Alerjik membran filtre taburcu et.</li>
			<li>Bir spatula ve ince forseps ile explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak transfer</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kültürlü explants bir reaktif toplam RNA izolasyonu için 1 ml bir spatula ile transfer edecek ve gen ekspresyonu çalışmaları için. Uyarı: Bu reaktif maruz ( Tablo malzemelerigörmek) bir ciddi sağlık tehlikesi olabilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek. İşleme yönergeleri izleyin ve üretici tarafından sağlanan güvenlik bilgi formları okuyun.</li>
	<li>Alternatif olarak, tavuk bebekleri E8, CAM üzerine kültürlü doku grefti. Adım 4'e izleyin.</li>
</ol>4. CAM hazırlanması
<ol><li>8 gün embriyonik gelişim ile tavuk yumurtası kuluçka makinesi kaldırın. Not: Yumurta hava odası 38 ° C oksijen kuluçka, yukarı doğru bakan ile inkübe.</li>
	<li>Yumurta kabuğu parçaları hava odanın içine düşmesini önlemek için şeffaf plastik bant ile künt sonu kapak. Kabuk dokunun ve yumurta dairesel bir açılış eğri makasla kesme. Hava odası görünür olmalıdır.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hava odası Beyaz zar ince forseps ile kaldırın. CAM sonra görünür ve ektopik doku nakli için erişilebilir. Not: PBS kayar ve explants saklanmalıdır PBS teşvik beri CAM, önce veya sonra nakli, hidrat için kullanmayın. Membran kurur, yumurta atmak.</li>
</ol>5. CAM üzerine kültürlü Explants ve aşılama
<ol><li>Küçük vasküler lezyonlar/yaralar cam bir tutucu bir microscalpel ile daha küçük damarları oluşturun. Not: Pasteur pipet ucu aşırı kanama durumunda capillarity tarafından kan kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Bir spatula ve ince forseps kültürlü explant CAM yaralı bölgeye aktarmak için kullanın.</li>
	<li>Bir filtre kağıt explant biraz daha geniş keser ve explant üst kısmında yerleştirir. Not: Filtre kağıdı gelişimi cam sonra explant konum izleme yardımcı olur. Gerekirse explant için günlük ilaç dağıtım ovo içinde geliştirme sırasında Ayrıca, sağlar (5.6 adımda anlatılan).</li>
	<li>Şeffaf plastik bant ile yumurta penceresini kapatın ve kömür kalem kullanarak tanımlar. Not: Plastik bant dehidratasyon kuluçka dönemi sırasında embriyo korur.</li>
	<li>Oksijen kuluçka 38 ° C'de 10 gün boyunca işlenmiş yumurta kuluçkaya Adım 6 izleyin.</li>
	<li>İsteğe bağlı adım: Kuluçka dönemi günlük ilaç idaresi.<ol>
<li>Filtre erişmek için kısmen plastik bandı kaldırın. Uyuşturucu çözüm, kağıdın üstüne damla damla, 100 µL ekleyin. Pencerenin yeniden mühürle ve yumurtayı geri oksijen kuluçka makinesi 38 ° C'de yer Not: Bu tahlil için Hh ovo içinde geliştirme5sırasında sinyal cyclopamine 20 µM doz yapılmasını engeller.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ektopik Organ oluşumu CAM Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra
<ol><li>10 günden, kuluçka yumurta kuluçka makinesi kaldır ve dikkatle plastik bant tutar.</li>
	<li>Eğri makas ve transfer CAM elde edilen explant küçük bir bardak için filtre kağıdı ile yaklaşık 3/4 soğuk PBS ile dolu kase kullanarak filtre bölgenin etrafında CAM kesti.</li>
	<li>İnce forseps yardımıyla CAM elde edilen explant siyah Bankası PBS 10 mL içeren bir 100 mm Petri kabına aktarın. Filtre kağıdı ve membran Wecker göz makas ve ince forseps kullanarak fazlalığı yavaşça çıkarın.</li>
	<li>CAM explant sabitleştirici eriyik-e doğru nakletmek (% 3.7 PBS PFA) bir kepçe ile. Tavuk bebekleri embriyo boyun bölgesinde büyük makas yardımıyla kesin bir kesim yaparak yumurtadan kaldırmadan ötenazi.</li>
	<li>Organ oluşumu CAM elde edilen explants bölümlerini parafin geleneksel Histoloji ve immünhistokimya tarafından değerlendirmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology.">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cells+into+organs:+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak,+feather,+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis.">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology.">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).</li><li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+pathway+in+the+developing+chick+lung:+expression+and+inhibition+studies.">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth.">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li><li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells.">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+trough+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu yöntemin başarısı için çok önemli bir yönü kalitesidir tavuk ve Bıldırcın yumurta. Göz önüne alarak uzun bir kuluçka dönemlerde, özellikle içinde ovo tahlil, kaliteli tavuk yumurta geliştirir canlılığı yordamının sonuna (%90) oranları. Bunu başarmak için yumurta farklı tedarikçilerden sınayın. Uzun süre unmanipulated yumurtaları kuluçkaya (ilâ 16-17 gün) ve gelişimlerini kontrol edin. Kaliteli toplu değerlendirilmesi için embriyo % 80'den fazla normal gelişim mevcut o...

Kuş embriyo seminal gelişim biyolojisi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kuş modelinin başlıca avantajları açmak için yumurta, embriyo ve embriyolardan gerçekleştirmesini nispeten kolay erişim imkanı bulunmaktadır. Bazı örnekler hücre kader1, uygulama2embriyo için belirli büyüme faktörlerinin ve CAM1,3ektopik hücresel yapılar büyüme çalışmak için klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemi oluşturan, 4.
Organ oluşumu farklı aşamalarında yeni görüşler elde etmek için biz son zamanlarda embriyonik dokular5 vitro manipülasyon ile aşılama teknikleri birleştiren bir yöntem geliştirdik. Ayrımcılık ve keşif, her iki erken - ve geç-sık sık son derece dinamik ve karmaşık doku etkileşimleri2nedeniyle sınırlı dönemlerinde organogenesis, iki aşamalı yaklaşım sağlar. Ayrıca, uygun doku özgü işaretleri eksikliği sık genetik olarak değiştirilmiş kısıtlar hayvan modelleri6. Bu roman yöntemi iki aşamalı yaklaşım, büyük ölçüde bu tür sınırlamalar üstesinden gelir.
Erken aşamalarında organ oluşumu, ilk adım, eğitim için potansiyel organ rudiment oluşan bıldırcın embriyonik bölge izole ve 48 h bir vitro organotypic sisteminde büyüdü. Bu dönemde belirli sinyal yollar farmakolojik modülasyon kültür orta5,7' ye uyuşturucu ekleyerek gerçekleştirilir. Ayrıca, kültürlü doku vitro büyüme herhangi bir aşamada toplanan olabilir ve gen-ifade için probed (qPCR, microarrays, vbgibi yöntemleri kullanarak).
İkinci adımda, 48 h kültürlü dokulara sonra tavuk (c) embriyo (cE8) embriyonik gün (E) 8, CAM aşılı (Hamburger ve Hamilton (HH)-33-35 aşamalarında)8. CAM besin vasküler bir tedarikçi olarak davranır ve onun geliştirme ovo içinde daha uzun süreler için etkinleştirme aşılı dokulara gaz alışverişi1,3,4 sağlar. Tam biçimli organları içinde ovo geliştirme5,9,10,11 10 gün sonra elde edilebilir gibi bu deneysel adım özellikle de geç-aşamaları organogenesis, çalışmaya uygun . Morfolojik analiz kolayca uygun organ oluşumu onaylamak için geleneksel Histoloji tarafından gerçekleştirilir ve donör kökenli hücre species-specific antikorlar (yani, MAb bıldırcın Perinükleer (QCPN)) kullanarak immünhistokimya tarafından belirlenebilir. CAM kuluçka döneminde Greftler Ayrıca huzurunda farmakolojik ajanlar yetiştirilen ve herhangi bir organogenesis ilerlemesini değerlendirmek için geliştirme aşamasında toplanan.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan iki aşamalı yaklaşım zaten Figueiredo vd. istihdam kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirme keşfetmek için 5 . Buna göre embriyonik topraklarının doğal özellikleri ve timus ve paratiroid bezleri içinde organogenesis ilgili gelişme aşamalarında aşağıda sunulacak.
Timus ve paratiroid bezleri epiteli, işlevsel olarak farklı olsa da, faringeal torbalar endoderm (PP)12türetmek. İçinde kuş, bu organların epiteli üçüncü ve dördüncü PP endoderm (3/4PP)12den, memelilerde timik epitel 3PP türeyen ve paratiroid bezleri epitel elde etmek 3PP ve 3/4PP fare ve insan kaynaklı, sırasıyla13,14.
Bu organların oluşumu en erken aşamalarında biridir ayrı timus ve paratiroid etki alanlarında ortak primordium ortaya çıkması. Tavuk, bu etki alanları, E4.515belirli moleküler imleçli in situ hibridizasyon tarafından belirlenebilir. Geliştirme devam ettikçe, bu organ esaslar kişiselleştirmek ve nöral crest kaynaklı hücreler tarafından ince bir mezenkimal kapsül (E5; onları çevreleyen iken yutak ayrı HH-stage 27). Daha sonra timik epitel (E6.5; hematopoetik progenitör hücreler tarafından kolonize HH-stage 30)12.
Klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar1,12olduğu gibi iki aşamalı yaklaşım hematopoetik/lenfoid organlar, yani timus5oluşumunu incelemek özellikle yararlıdır. Bıldırcın, organ rudiment ile explant olarak aşılı hematopoetik progenitör hücre kolonizasyon önce tavuk embriyo chimeric timus bir bıldırcın timik epitel muadili infiltre tavuk kan yoluyla progenitör hücre ile oluşturulur. Bu yöntem, bu nedenle, kuş hemato/lenfoid sistemi geliştirilmesi hematopoetik hücrelerin katkısını keşfetmek için yararlı bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>Chicken fertilized eggs (&lt;em&gt;Gallus gallus&lt;/em&gt;)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Poultry farm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quail fertilized eggs (&lt;em&gt;Coturnix coturnix&lt;/em&gt;)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Bird farm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm pyrex dishes</td><td>Duran group</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm pyrex dishes</td><td>Duran group</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate Membrane Insert&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane filter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 mm Isopore membrane filter</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex bowls</td><td></td><td></td><td>from supermarket&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL plastic pipet</td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;qualitative filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Filter paper</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td></td><td></td><td>from supermarket&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Pharmacological inhibitor of Hh signalling</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&amp;nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>To prepare the back base for petri dish</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Pharmacological inhibitor of Notch signalling</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagent for total RNA isolation</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&amp;nbsp;</td><td>Thin forceps</td></tr><tr><td>Extra fine Bonn scissors, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Curved scissors</td></tr><tr><td>Insect pins&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatula&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantation spoon</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Holder</td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

two-step approach to explore early- and late-stages of organ formation in the avian model: the thymus and parathyroid glands organogenesis paradigm

Kuş embriyo deneysel bir model gelişim biyolojisi seminal buluşlar için son derece önemli olmuştur. Birkaç yaklaşım, bıldırcın-tavuk chimeras oluşumu ve chorioallantoic membran (ektopik doku tarihinden geriye son yüzyılda gelişimi sürdürmek için CAM) kullanımı arasında. Günümüzde, son vitro metodolojileri ile klasik bu tekniklerin birleşimi roman umutları daha fazla organ oluşumu keşfetmek için sunuyor.
Burada ilk - ve geç-aşamalarında organogenesis çalışmaya bir iki adım yaklaşım tarif. Kısaca, embriyonik bölge organ meşru bölge içeren bir organotypic sistemi (en fazla 48 s) içinde bıldırcın embriyo ve yetişkin vitro izole edilmiştir. Kültürlü doku daha sonra tavuk embriyo CAM aşılı. Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra tam biçimli organları aşılı dokulardan elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda vitro ve ovo içinde gelişimsel adımları boyunca doku genetik manipülasyon ve farmakolojik düzenli yönetim tarafından yolları sinyal modülasyonu sağlar. Ayrıca, onların (kullanarak kantitatif PCR (qPCR), microarrays, vb) gen ekspresyon profili ve Morfoloji (geleneksel Histoloji ve İmmünokimya ile değerlendirildi) çözümlemek için herhangi bir zaman penceresi, dokularda gelişen toplanabilir.
Açıklanan deneysel işlemin organ oluşumu tam olarak kurulan organogenesis erken dönemlerinde ve fonksiyonel organları kuş embriyo dışında takip için bir araç olarak kullanılabilir.

Yukarıdaki Protokolü ayrıntıları araştırma, her iki erken - ve geç-dönemlerinde organogenesis, sık sık hücresel ve moleküler karmaşık etkileşimler tarafından sınırlı izin veren bir yöntem tarif etti.
Bu yöntem daha önce Figueiredo vd. istihdam edildi Çentik ve kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirilmesinde sinyal Hh rolü çözülmeye 5 .
<p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm at JoVE.co

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.4K Görüntüleme.  Universidade de Lisboa. Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.

Video: Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Gelişim Biyolojisi

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

Tıp

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biyoloji

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the strengths of this model system is that the effect of, and interaction among, tissues can be directly assessed in chimeric embryos. We have previously shown that signals from the forebrain contribute to facial morphogenesis by regulating the shape of the expression domain of Sonic hedgehog (SHH) in the Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). In this article, the method of generating the forebrain chimeras and provide illustrations of the outcomes of these experiments is described.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of basal forebrain&#160;during craniofacial development.

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

Avian Embryonic Skin Explant Kültür Protokollerinin Kapsamlı Bir Derlemesi

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Yazar Spotlight: Mevcut Deneysel Kuş Derisi Eksplant Metodolojilerine İlişkin Bakış

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPSC'den Türetilmiş Organoidlerle Timik Mikro Ortamın Yeniden Oluşturulması

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: İnsan Timik Organoidleri ile Timik Epitel Hücrelerini ve T-Hücresi Araştırmalarını İlerletmek

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

İlk - ve geç-aşamalarında Organ oluşumu kuş modelindeki keşfetmek için iki adımlı yaklaşım: timus ve paratiroid bezleri Organogenesis paradigma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Yalıtım embriyonik doku ve timus örnek kullanarak bıldırcın-tavuk Chimeric organ oluşumu

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Doku Desenini ve Organogenezi İncelemek için Kuş Derisi Eksplantlarının Kullanılması

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu