我々は寛大に受精卵を提供するためのタイソンフーズ社を認識したい。シャナアーノルドは、このプロトコルの撮影の間に尽力した。 Trenisパーマーは、ルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞（F31国立がん研究所）の下に国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、部分的にJDLとNIH / NCIの助成金＃CA120711 - 01A1とCA120711 - 01A1にAZにCCSRIグラント＃700537によってサポートされていました。

1。 xenograftingために卵を準備する（自然転移） <ol><li>たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で10日間回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。 </li><li>発達10日目に卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。 </li><li>漿尿静脈が位置し、マークされます。この静脈は、それはいくつかの大きな血管の接合である卵殻の最上部に位置しています。この分岐点で血管がCAMから離れて、低下し、胚に取り付けます。 1センチメートル四角いボックスは、静脈の分岐点から約1cm離れて卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。 </li><li>シリコンカーバイド砥石（ドレメルの一部＃84922）穴を装備した回転切削工具（ドレメル）を使用することは気嚢に卵の鈍端貫通されています。この同じツールを使用して穴が卵殻膜の短い停止、卵の上に以前に描かれた正方形の中に掘削されている。最後に微細ないが、25ゲージの注射針は、基礎となるCAMを引き裂くように注意して卵殻膜に小さな穴を作るために使用されます。 CAMは、その後airsacの穴に対して置か¼&quot;タイゴンチューブの部分を装着した自動ピペットエイドで作成された穏やかな吸引を用いて正方形の面積の卵殻膜から切り離される。吸引を適用する際に、エアポケットは、角の穴の下にCAMが正常に卵殻から削除されていることを示す必要があります。 CAMが削除された後は、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を移植するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。 </li></ol> 2。静脈内注射（実験的転移）のために卵の準備<ol><li>たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で12日間の回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。 </li><li>発達の日の12卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。 </li><li>漿尿静脈が位置し、マークされます。 0.5センチメートルの長方形で1センチメートルが直接静脈上記の卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。 </li><li>小さなウィンドウがDremmelのドリルビット（＃118）を使用して描画場所で卵の殻に作成されます。ウィンドウは、その後、ミネラルオイルの低下と透明度でレンダリングされる、基になる卵殻膜を露出するために削除されます。グラフィカル用図5aを参照してください。 </li><li>この時点で、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を注入するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。 </li></ol> 3。移植または注入のために腫瘍細胞を準備する。 <ol><li> xenograftingの場合は、腫瘍細胞は、トリプシン/ EDTAを使用して培養皿からから切り離されているとリン酸の10倍量で洗浄し、残ったメディア、トリプシン、またはEDTAを除去するために緩衝食塩水（PBS）。 </li><li> IV注射の場合は、培養細胞は非酵素的細胞解離液を用いて分離される、および無血清DMEMで洗浄した。と） </li><li>細胞は血球計でカウントし、移植のために10から40000000細胞/ mlでPBSに再懸濁し、あるいは静脈注射の場合は1万細胞/ mlになるように無血清DMEMに再懸濁する。 </li></ol> 4。新たに露出したCAM（自然転移）に腫瘍細胞を移植<ol><li>卵はインキュベーターから削除され、小さなウィンドウが新しい空気のポケットが形成され、以前に描かれた四角の場所にカットされます。これは最も簡単にカッティングホイール（＃409円形の切断ホイールでドレメルツール）を装備した回転工具を使って行われます。ニードルノーズピンセットは、卵殻の小さなセクションを除去し、配下のCAMを公開するために使用されます。 </li><li>綿棒を（フィッシャーブランド＃23-400-001）を使用してCAMは、5回を摩耗されています。少し血は綿に明らかであろう。すぐにCAMを損傷した後、細胞懸濁液の25μlのは、損傷した領域に配置されます。細胞の最適な数が決定される電子です。mpiricallyが0.5 × 10 5〜1 × 10 6の範囲で指定できます。卵の窓をテープでしっかりと密封され、雛は細胞が沈殿することを可能にするために10〜15分放置されています。 15分後に卵が静止インキュベーターに戻されます。 </li><li>腫瘍は、特定のアプリケーションと使用する腫瘍細胞株の性質に応じて5-8日のために拡張されます。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。 </li></ol> 5。腫瘍細胞の静脈内注射（実験的転移） <ol><li>細胞懸濁液の30ゲージのインスリンシリンジ100μLの使用は、各胚の尿膜静脈に注入され、卵が静止インキュベーターに戻し、追加の1-7日のためにそこに残った。 </li><li>異なる時点で、肺または下CAMは、それぞれの胚から採取されると下記のように、腫瘍細胞の検出のために処理した。 </li></ol> 6。収穫腫瘍とひよこの組織<ol><li>解剖領域が用意されています。アッセイは高感度PCR法を用いてヒトのDNAを定量することにより転移性細胞を検出します。それは、外来DNAの混入を防止することが非常に重要です。解剖は、専用エリアで行われ、解剖を通してのツールは、それぞれの動物の間にクリーンアップされます。解剖の過程で、サンプルのクロスコンタミネーションを防止するために、ツールの3つの別個のセットが使用されています：卵を切断するための一組、一次腫瘍を除去するための一組と内臓を除去するための一組を。また、4つの洗浄容器は、各動物betweenツールのすすぎシーケンシャルに使用されます。シーケンスにこれらの洗浄は次のとおりである：1）蒸留水、2）蒸留水、3）塩素系漂白剤、及び4）70％エタノール。 </li><li>卵は、静止インキュベーターから除去し、動物を麻酔し、安楽死させる15分間氷上に配置されます。ウィンドウは、腫瘍が見えてくるように開かれます。卵殻の一部を除去することにより大きなウィンドウを開くと、必要な場合があります。原発性腫瘍は、CAMから切除秤量し、組織学のために処理されます。 </li><li>ひよこは等しい半分に放射状に殻をカットすることで卵殻から削除されます。胚は、カットのシェルからデカントし、クリーンアップ重量ボートの胸の側に転送されます。動物は、ツールの新鮮な、きれいなセットを使用して切開されています。動物は、胸骨を切開によって開かれます。胚が開いたら、右または左葉から肝の部分が収集されます。内部器官はその後砂嚢に接続されている食道を軽く引っ張り、臓器を接続viseraを切断して除去される。肺がカット収集するためには胸郭は胸のプレートが分離されていると心が削除される開かれます。この時点では、肺の四辺の周囲にカットすることが可能です（ヘッドに最も近い上部胸郭、気管に沿って横隔膜と右側の近く下部に沿って左側）。一貫性を保つため、同じ肺は各動物で収集されます。収穫された組織サンプルは、後で使用するために-20℃で保存されている、またはDNAの分離のためにすぐに処理することができます。 </li></ol> 7。ゲノムDNAの分離および定量的PCR解析<ol><li>ゲノムDNAは、SYBRグリーンエキス- N - Ampの組織PCRキット（Sigma - Aldrich社カタログ＃XNATRG）を使用して、組織から抽出されます。抽出されたDNAは、きれいなエッペンドルフチュー​​ブに移し、-20℃で保存するか、すぐに使用することができます。その後のPCR反応で使用する前にヌクレアーゼフリー水でDNAを1:50に希釈することが重要です。また、DNAは標準的なDNA抽出プロトコール（ザイルストラら 、2002）の任意の数を使用して抽出することができます。 </li><li>人間のDNAをヒトのALUシーケンスのための定量的PCRの特定を使用して、ニワトリ組織で検出される。 ALU -特異的プライマーを用いた定量的PCRをExract - N - AmpのキットからSYBRグリーン増幅を使用して実行されます。 PCRキットは、SYBRグリーン、バッファー、塩のdNTPs、TaqポリメラーゼおよびJumpStart Taq抗体を含む2倍の反応ミックスが付属しています。反応ミックスは、各プライマーの0.4μMで、15μlの最終容量で構成されています。 1:50に希釈抽出したDNAを使用するほとんどのインスタンスは、定量的なデータを提供するために、しかし、テンプレートDNAの最適量は経験的に最適化する必要があります。ニワトリGAPDHのプライマーは、PCRがALUの配列について以下の条件の下で実行される内部コントロールとして使用されています：95℃ポリメラーゼの活性化95℃30サイクルで2分間のC℃で30秒、63℃の30秒30秒のため、72 ° CチキンGAPDHの反応条件は、ALUのために説明したものと同一であるしかしそれは、40サイクルのPCRを拡張する必要があるかもしれません。 </li><li>転移の定量分析は、（SchmittgenとLivak、2008対照群と実験群を比較するΔΔCT法を使用して実行されます。ザイルストラら 、2。002）。あるいは、標準曲線は、エキス- N -アンプキット（ザイルストラら 、2002）を用いて抽出されたヒト腫瘍細胞の希釈系列を使用して生成することができます。統計学的有意差はStudentのt検定または対照群と実験群の分散分析を用いて評価されます。 </li></ol> 8。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。ニワトリ胚転移モデル。重要なステップの断面のモデルの外観を示すA）4つのパネルの図：1。インキュベーションの10日後。 CAMは、ほぼ最大サイズに達しました。動脈と静脈は、卵の上にリフト尿膜静脈とはっきりと表示されます。 2。すぐに卵の殻に2つの穴を掘削後の卵：airsacに1つ、尿膜静脈の接続点に隣接する1。 3。軽度の真空後の外観は、airsacを避難し、CAMを削除するために使用されています。腫瘍細胞（青）がドロップされたCAMに適用されます。 4。接木腫瘍細胞が成長させた後、ニワトリ胚からの組織とともに腫瘍を分析用に採取されるB）モデルのシリアル描写：1。卵をインキュベートする。2。尿膜静脈の位置をマーキング。、3。卵殻に穴をあける。4。 CAMを削除。、5。移植腫瘍細胞。、6の開口部を切断。腫瘍細胞を適用する。、7。組織を収集する前に氷の上に卵を冷却する。、8。成長の7日後に腫瘍を収穫。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。CAMの腫瘍の組織学。担癌漿尿膜から採取した組織はホルマリン、切片で固定し、トリクローム染色で処理した。 CAM上の成長の7日後A）HEp3腫瘍。 BとCが示す腫瘍と間質の両方から拡大された領域を示しています。 D）法線CAM。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。転移の定量的な縦分析 。ハイまたはロー転移能（HEp3 M（高）と、それぞれHEp3 M（低））と頭頸部癌HEp3のためのバリアントはアルミPCRを使用して発信する能力について分析した。 10匹は7日間の期間中、各時点で分析した。これらのサンプルは標準曲線に対して定量化し、続いて＃組織をcells/50mgとして表した。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。転移を阻害する抗体1A5で処理した動物の自然転移細胞の抑制 。腫瘍は日- 10胚のCAMに適用される5 × 5 HEp3細胞を用いて形成した。 half動物は抗CD151抗体1A5で処理した腫瘍細胞を適用した3日後。腫瘍を有する動物からの肺は、二日後に採取し、定量的リアルタイムALU PCRを行った。逆にchGAPDHの定量的リアルタイムPCRは、宿主のゲノムDNA（ΔΔCT法を定量的に二つのグループ（B）を比較するために使用されたのと同等の量の存在を確認するために使用されていました。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。転移カスケードで逮捕、成長、および脈管内への評価 。逮捕、成長率、および管内の速度：基本的に、二次臓器への転移は、三つの側面の貢献によって定義されます。これらは、実験的転移（）と自然転移（B）の組み合わせを用いて定量することができます。実験的転移（）セルの数が2時間後の注射を検出したとして逮捕が定義されているを使用する。逮捕された細胞の生存と成長は、細胞数24注射後の変化として決定されます。成長は日3月7日の間に増殖の速度として定義されています。管内は、（B）数intravasated細胞は、6日目に転移性の負担の現在の成長が予測値を超えると7日目に転移性の負担の存在として定義されている自然転移を用いて決定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。 CAMでの転移の可視化拡大 。 GFPを発現するHEp3細胞は、発達12日目に静脈内注射した。 1日目、3日と5日に卵を屠殺され、CAMのセクションは、蛍光実体顕微鏡で画像化した。濃い緑色の背景には卵の殻によって作成され、血管系は黒線で表示されており、腫瘍細胞は、明るい緑色の斑点として表示されます。

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	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li><li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment.">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+(PETA-3/CD151)+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis.">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ひよこCAMは、癌の生物学および転移性の進行のさまざまな側面を研究するモデル系として何十年も使用されています。転移能力の原則の評価休眠の分析を含むグループの様々なことで、このモデルで実行されている（アギーレGhiso ら 、1999;。オソウスキと帝国、1983）、組織のリモデリング（Deryugina ら 、2005;。ハーンDantona ら 、1999）、および転移（ザイルストラら ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 1Xダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（D - PBS）（1X）、液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190250 </td><td> pH7.4の</td></tr><tr><td> EDTA 4NA、液体とトリプシン、0.05％（1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td>スポーツマンハッチャー</td><td>ベリーヒル</td><td> 1550HA </td><td rowspan="2">これらのインキュベータは、最も容易に利用可能の一部です。しかし、ビデオは別の機器が表示されます。 </td></tr><tr><td>スポーツマンインキュベーター</td><td>ベリーヒル</td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td>ドレメルロータリーツール</td><td>ドレメル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドレメルのカットオフホイールありません。 36 </td><td>ドレメル</td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td>ポータブルピペットエイド</td><td>フィッシャー</td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td>綿は、アプリケーターのチップソー</td><td>フィッシャー</td><td> 23-400-001） </td><td></td></tr><tr><td>受精卵</td><td>様々な</td><td></td><td>多くの異なるベンダーを使用することができます。卵は約35〜55グラムにする必要があります。それらは年齢36〜55週になるはず産む鶏。 </td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausserサイエンティフィック、VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバ顕微鏡の照明</td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25ゲージの針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーンエキス- N - Ampの組織PCRキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

転移癌細胞が原発腫瘍から発信時には、周囲の組織に侵入し、遠隔臓器に転移する。転移は、多くの組織の種類、スパン可変の期間を含む、しばしばそれが困難な調査と定量化すること、臓器の深部に発生する可能性がある複雑なプロセスです。さらに、転移プロセスの有効性は、それが困難な腫瘍細胞の挙動の一つの側面の寄与を評価すること転移カスケードに複数のステップに影響されます。結果として、転移アッセイは頻繁に転移を研究するために、必ずしも現実的なコンテキストを提供するために、実験動物で行われます。残念ながら、これらのモデルは、彼らの複雑な生理機能によってさらに複雑です。ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）、腫瘍細胞のxenograftingに受け入れている卵の殻の下にある血管に富んだ超胚組織のアクセシビリティのために、転移を研究するために多くの制限を克服する生体モデル内で一意です。 （図1）。また、ニワトリ胚は自然に免疫不全であるため、CAMは簡単に正常細胞と腫瘍の両方の組織の生着をサポートしています。最も重要なことは、鳥類のCAMは、正常に増殖、浸潤、血管新生、および微小環境の改造を含め、ほとんどのがん細胞の特性をサポートしています。これは、癌の転移につながると新たな潜在的な治療への転移性癌の応答を予測するために経路の調査のためのモデルは非常に便利です。種特異的アルバリPCRによる播種細胞の検出は、定量的に25セルのように少数で保菌している臓器に転移を評価することが可能になります。ヒト類表皮癌細胞株（HEp3）を使用して我々は、ニワトリの肝臓、肺など遠くの臓器にがん細胞の自然転移を分析するためにこのモデルを使用してください。また、ALU - PCRのプロトコルを使用して我々は、転移の個々の要素として管内、逮捕、血管外漏出、および植民地化を分析し、定量するためのツールと​​して、アッセイの感度と再現性を示しています。

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Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

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18.9K ビュー.  Vanderbilt University. 定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。

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An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

マウス膀胱癌の同所性モデル

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

医学

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

定量的な可視化と動的な熱画像を用いた皮膚癌の発見

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

磁気共鳴イメージング、体積CT画像と超音波を用いた乳がんの骨転移のヌードラットモデルにおける血管新生のマルチモーダルイメージング

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

骨転移モデル

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

腹腔内卵巣癌転移の定量

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...