저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).

이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정된 메 추 라 기 계란의 부 화
<ol><li>품 어 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)와 닭고기 (갈 루스 갈 루스) 수정 된 달걀 3, 8 일, 각각.<ol>
<li>38 ° c.에 습도 인큐베이터에 향하도록 공기 챔버 (계란 무뚝뚝한 끝)와 계란 배치</li>
		<li>약 20 메 추 라 기 계란과 40 닭 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하. 참고:이 숫자는 처음으로이 절차를 설정할 때 배가 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 절연 Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 메 추리 배아 영역의
참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.
<ol><li>에 대 한 큰 붕 규 산 유리 그릇을 준비 3/4 가득 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션.</li>
	<li>껍질을 활용 하 여 원형 개통의 무뚝뚝한 끝의 반대 측에 곡선가 위 메 추 라 기 계란을 외피의 3 일 후 엽니다. 조심 스럽게 껍질 제거 하 고 차가운 PBS 가득 유리 그릇에 배아를 전송.</li>
	<li>E 3에서 메 추 라 기 (q) 배아를 잡고 (qE3) (메 추 라 기 단계에 해당 하는 닭의 HH 단계 21) 얇은 겸의 도움으로. 노 른 자 곡선된가 위를 사용 하 여 포함 하는 vitelline 막에 상처를 확인 합니다. 잘라 및 외부 여분의 배아 혈관의 둘레를 계속 합니다.</li>
	<li>양도 작은에 배아 그릇 약 3/4 차가운 PBS 얇은 겸의 도움으로 가득. 나머지 연결 된 노 른 자에서 배아는 철저 하 게 세척.</li>
	<li>스키 머를 사용 하 여 100 m m 유리 블랙 기본 페 트리 접시에 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하.</li>
	<li>아래는 stereomicroscope 페 트리 접시를 놓습니다. 참고:이 시점에서 앞으로, 진보적인 확대에 대 한 미세 절차는 stereomicroscope 아래를 수행 합니다. 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 조명을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>얇은 곤충 핀 접시의 바닥에는 배아를 잡으십시오. 여분 미 발달 지역에 사각형 모양을 형성 하는 4 개의 핀을 배치 합니다.</li>
	<li>얇은 겸의 도움으로 두 부 영역의 여분의 배아 세포 막을 제거 하 고 거기 5 핀을 배치. 참고: 경우 태아는 올바르게, 다음 otic 소포, 심장 관 1성, 2nd및 3rd 인 두 아치 (Pa) 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>Wecker 눈이 위를 사용 하 여 관심, 즉, 3층 및 4회 인 두 아치 지역 (3/4PAR)의 미 발달 지역의 해 부.<ol>
<li>배아 축 somite/신경 튜브 영역과 파 사이 경도 평행을 절단 시작 합니다.</li>
		<li>그것을 절단 하 여 ventrally 위치 심장 튜브를 제거 합니다. 같은 위치에 유지가 위, 컷의 방향으로 태아 위치를 페 트리 접시 회전.</li>
		<li>2차 및 3rd 파 사이 잘리고 실바 4번째 아래</li>
		<li>얇은 포 셉의 도움으로 3/4PAR에서 나머지 막 분리 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>격리 된 조직 (3/4PAR) 및 유리 접시 3/4에 그들 가득 차가운 PBS 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 전송 발음. 참고:이 하, 조직 성장 생체 외에서 최대 48 h 또는 수 E8에서 닭 배아의 캠에 즉시 투입 될.</li>
	<li>생체 외에서 시험 준비 하는 동안 얼음에 격리 된 3/4PAR를 포함 하는 유리 접시를 유지.</li>
</ol>3. 생체 외에서 Organotypic 분석 결과: Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역의 문화
<ol><li>10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다. 참고: 약리 성 시 약은 매체 (예를 들어 LY-411.575 (정) 및 디-benzazepine 또는 cyclopamine 그리고 vismodegib, 노치 및 Hedgehog (Hh) 신호 경로 각각 하에 추가할 수 있습니다. 이 분석 결과 대 한 광의 50-200 nM 또는 디 benzazepine의 5-15 µ M를 사용 하 여 노치 3에 신호 억제/4PAR. 3/4PAR5에서 Hh 신호를 억제 하기 위해 cyclopamine의 20 µ M 또는 vismodegib의 10 µ M를 사용.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 3/4PP explant의 생체 외에서 문화를 준비 합니다.<ol>
<li>6 잘 플레이트에서 한 잘 문화 매체의 5 mL을 채우십시오. 24 m m 폴 리 카보 네이트 막 삽입 장소 ( 테이블의 자료를 참조)에 얇은 겸의 도움으로 잘.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 막 표면에 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드럽게 밀어 넣어 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 막 삽입 당 최대 7 explants 추가 합니다. 3.4 단계로 진행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 문화 explants 부동 멤브레인 필터에.<ol>
<li>35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL을 준비 합니다. 얇은 포 셉, 멤브레인 필터 ( 재료의 표참조) 시키고 공기와 접촉 건조 표면 부동의 도움으로.</li>
		<li>Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 멤브레인 필터를 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩으로 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 멤브레인 필터 당 최대 8 explants 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조심 스럽게 explants 3.2 및 3.3 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 단계에 놓습니다.</li>
	<li>48 h 잠복기 후 인큐베이터에서 6 잘 플레이트와 35 mm 페 트리 접시를 제거 합니다.<ol>
<li>6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.<ol>
<li>실 온 (RT)에서 막 삽입 PBS를 추가 합니다.</li>
			<li>2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 활발 한 홍 조 explants는 막에서 분리 합니다.</li>
			<li>주걱과 얇은 겸의 도움으로 실시간에 PBS를 가진 채워진 유리 접시 3/4에 교양된 explants 전송</li>
		</ol>
</li>
		<li>마찬가지로, 35 mm 페 트리 접시에에서 떠 있는 멤브레인 필터에서 교양된 explants를 수집 합니다.<ol>
<li>실시간에 PBS를 가진 채워진 새로운 35mm 페 트리 접시에 얇은 집게와 멤브레인 필터를 전송</li>
			<li>활기찬 pipetting 사용 하 여 2 mL의 멸 균 플라스틱 피펫은 explants 멤브레인 필터에서 분리 합니다.</li>
			<li>얇은 포 셉의 도움으로, 그것에 연결 된 아무 explants 남아 확인 후 explant 무료 멤브레인 필터를 방전.</li>
			<li>주걱과 얇은 집게, 전송 explants 유리 접시에 담긴 실시간에서 PBS</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 RNA 격리에 대 한 시 약의 1 mL를 주걱으로 교양된 explants 전송 및 유전자 발현 연구에 대 한 사용. 주의: 이 시 약에 노출 ( 재료의 표참조) 심각한 건강 위험 수 있습니다. 적절 한 보호 안경, 의류, 장갑 착용. 처리 지시 하 고 제조업체에서 제공 하는 안전 데이터 시트를 읽어.</li>
	<li>또는, E8에서 닭 배아의 캠에 교양된 조직 이식. 4 단계를 따릅니다.</li>
</ol>4입니다. 카메라의 준비
<ol><li>인큐베이터에서 배아 발달의 8 일 닭 계란을 제거 합니다. 참고: 계란 습도 인큐베이터에서 38 ° C에서 위쪽으로 직면 하는 공기 챔버와 인 큐베이 팅 했다.</li>
	<li>공기 챔버에 떨어지는 포탄의 조각을 방지 하기 위해 투명 한 플라스틱 테이프와 계란의 무뚝뚝한 끝을 커버. 셸을 누르고 곡선가 위 계란에 원형 개통을 잘라. 공기 챔버 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>제거 주의 공기 챔버의 흰색 막 얇은 집게와. 캠은 다음 볼 수 및 소성 조직 이식에 대 한 접근. 참고: 이후 PBS 슬라이딩과 방치는 explants의 촉진이 이식, 전후 캠, 수 화를 PBS를 사용 하지 마십시오. 막 밖으로 건조, 계란을 폐기.</li>
</ol>5. 교양된 Explants는 캠에의 접목
<ol><li>에 홀더 microscalpel와 카메라의 작은 혈관에서 작은 혈관 병 변/상처를 만듭니다. 참고: 주입구 과잉 출혈의 경우에 의해 혈액을 제거 하는 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다.</li>
	<li>주걱과 얇은 집게를 사용 하 여 카메라의 부상 영역 교양된 explant 전송.</li>
	<li>필터 종이 explant 보다 약간 잘라내어는 explant 위에 그것을 배치. 참고: 필터 종이 캠에 개발 후 explant 위치를 추적 도움이 됩니다. 또한, 그것은 매일 약 하 배달을 허용는 explant 비켜에서 개발 하는 동안 필요한 경우 (5.6 단계에서 설명).</li>
	<li>투명 한 플라스틱 테이프와 계란 창 인감 및 목탄 연필을 사용 하 여 식별 합니다. 참고: 플라스틱 테이프는 잠복기 동안 탈수에서 태아를 보호 한다.</li>
	<li>38 ° c.에 습도 인큐베이터에서 10 일 동안 조작된 달걀을 품 어 6 단계를 따릅니다.</li>
	<li>선택적 단계: 잠복기 동안 매일 약물 행정.<ol>
<li>필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치 참고:이 분석 결과 대 한 cyclopamine의 20 µ M의 복용량은 억제 비켜 개발5동안 Hh 신호.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 소성 기관 형성 카메라에 비켜에서 개발의 10 일 후
<ol><li>10 일 후 부 화, 인큐베이터에서 달걀을 제거 하 고 플라스틱 테이프를 신중 하 게 철회.</li>
	<li>캠 곡선된가 위 및 작은 유리 필터 종이 캠 파생 explant 약 3/4 차가운 PBS 가득 그릇을 사용 하 여 필터 영역에 주위 잘라.</li>
	<li>얇은 겸의 도움으로 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 캠 파생 explant 100 mm 페 트리 접시에 전송. 부드럽게 필터 종이 Wecker 눈이 위를 사용 하 여 집게를 얇은 막의 과잉을 제거 합니다.</li>
	<li>캠-explant 통 솔루션에 전송 (3.7 %PBS PFA) 스키 머와 함께. 큰가 위의 도움으로 태아의 목 지역에 정확한 컷 하 여 난 자에서 그들을 제거 하지 않고 닭 배아를 안락사.</li>
	<li>전통적인 조직학 및 immunohistochemistry 캠 파생 explants의 파라핀 섹션에서 기관 형성을 평가 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전...

조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.
기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.
첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등등과 같은 메서드를 사용 하 여).
두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.
깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 외 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.
Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,은14입니다.
이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.
클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Pintobar, Portugal</td>
			<td></td>
			<td>Poultry farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)</td>
			<td>Interaves, Portugal</td>
			<td></td>
			<td>Bird farm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL PP centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td>21 755 41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 20 mm pyrex dishes</td>
			<td>Duran group</td>
			<td>21 755 48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Membrane Insert&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td>24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>DTTP01300</td>
			<td>0.6 mm Isopore membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5112&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex bowls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2041S</td>
			<td>2 mL plastic pipet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>normax</td>
			<td>5426015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1001090</td>
			<td>Filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from supermarket&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td>
			<td>BMA Biomedicals</td>
			<td>T-1302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4116</td>
			<td>Pharmacological inhibitor of Hh signalling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Standart FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QCPN antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>QCPN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td>
			<td>ELKEM/Silmid</td>
			<td>RH141001KG</td>
			<td>To prepare the back base for petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule LY411575</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0054</td>
			<td>Pharmacological inhibitor of Notch signalling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Reagent for total RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30&#160;</td>
			<td>Thin forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra fine Bonn scissors, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td>Curved scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spatula&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10087-12</td>
			<td>Transplantation spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td>Microscalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26016-12</td>
			<td>Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-17</td>
			<td>Skimmer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wecker Eye Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15010-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td>MC170 HD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step approach to explore early- and late-stages of organ formation in the avian model: the thymus and parathyroid glands organogenesis paradigm

조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.
여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외 고 비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, 등) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.
설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.

위의 설명 프로토콜 세부 사항을 조사의 두 초기-및-의 후기 종종 복잡 한 세포 및 분자 상호 작용에 의해 제한 organogenesis 허용 하는 방법.
이 방법은 이전 Figueiredo 외 에 고용 되었다 노치와 Hh 신호 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발에서의 역할을 해명 하기 5 .
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

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Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.4K 조회수.  Universidade de Lisboa. 이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

비디오: Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, and stress response. More than a decade ago, stem cells were identified in the pituitary gland. However, despite the application of transgenic in vivo approaches, their phenotype, biology, and role remain unclear. To tackle this enigma, a new and innovative organoid in vitro model is developed to deeply unravel pituitary stem cell biology. Organoids represent 3D cell structures that, under defined culture conditions, self-develop from a tissue's (epithelial) stem cells and recapitulate multiple hallmarks of those stem cells and their tissue. It is shown here that mouse pituitary-derived organoids develop from the gland's stem cells and faithfully recapitulate their in vivo phenotypic and functional characteristics. Among others, they reproduce the activation state of the stem cells as in vivo occurring in response to transgenically inflicted local damage. The organoids are long-term expandable while robustly retaining their stemness phenotype. The new research model is highly valuable to decipher the stem cells' phenotype and behavior during key conditions of pituitary remodeling, ranging from neonatal maturation to aging-associated fading, and from healthy to diseased glands. Here, a detailed protocol is presented to establish mouse pituitary-derived organoids, which provide a powerful tool to dive into the yet enigmatic world of pituitary stem cells.

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary gland is the key regulator of the body's endocrine system. This article describes the development of organoids from the mouse pituitary as a novel 3D in vitro model to study the gland's stem cell population of which the biology and function remain poorly understood.

뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하기 위해 시험관 내 모델로 마우스 뇌하수체에서 오가노이드 개발

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...