モノクローナル抗体は、単一のBリンパ球クローンと同じエピトープに結合する一価抗体から産生される単一特異的抗体として知られている。近年、モノクローナル抗体ベースのELISAは、食品や天然物の定性的または定量的な分析のための新たなプラットフォームとなっています。この方法は、面倒な前処理のステップを伴わない正確で、敏感で効果的な方法です。
それが生物学的サンプルと将来の臨床応用に不可欠です。TCMのmABの調製は、TCM式の複雑なシステム特性に関する研究において重要なステップである。我々は、人工抗原合成、マウス免疫、細胞融合を含む小分子化合物に対してmABを生成するプロトコルを開発した。
ハプテンをキャリアタンパク質と連結して人工抗原を合成する。人工抗原と完全なアジュバントが混合され、乳化される。マウスを皮下注射で免疫した。
免疫マウスの脾臓を取り出し、単細胞懸濁液を作ります。骨髄腫細胞を混合します。脾細胞は、PEG法によりHAT感受性マウス骨髄腫細胞株と分離および融合される。
ELISAにより抗体を調製することができる細胞株を選択する。抗原に反応性のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマはクローン化される。ハイブリドーマ細胞株が凍結保存されていることを確立する。
ナリジンBSAコンジュゲートの合成に歯分化酸化手順を用いた。まず、ナリジンを、5ミリリットルのナリジン溶液に調製した新たに調製したパラオデート溶液の100マイクロリットルで1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度で溶解した。室温で1時間かき混ぜます。
第二に、ナリチンナトリウムのイラリン酸反応混合物に2ミリリットルのキャリアタンパク質を加える。pH 9溶液に混合物を調整し、6〜8時間反応し続けます。第三に、人工抗原をPDSで3日間透析法で精製し、CBSを疎遠にした。
フロイントの完全なアジュバントと不完全なアジュバントは、マウスの免疫のために使用されました。ワクチン接種のために、50マイクログラムのコンジュゲートとフロイントの完全なアジュバントの同じ量を混ぜ、完全に乳化する。この混合物の100マイクログラムを各BALB/cマウスに対して、下皮下注射を介して管理する。
不完全なアジュバントと混合コンジュゲートの同じ量で2週間後に皮下注射を介してブースターワクチン接種を提供します。一次免疫のために、フロイントの完全なアジュバントおよび免疫原を皮下注射を介して使用した。ブースター免疫のために、フロイントの不完全なアジュバントと免疫原は皮下注射を介して使用された。
アジュバントを伴わない影響免疫化のために、皮下注射または膜内注射を介して免疫原のみを使用した。フィード層細胞は、主に腹部上皮細胞またはマクロファージに由来する。RPMI 1640 FBSおよびHATは、HATスクリーン媒体を調製するために使用された。
HATサプリメントを10ミリリットルRPMI培地に溶解し、その後、20%FBSを含む500ミリリットルRPMI 1640に添加した。そしてICRマウスを、75%エチルアルコールで5分間殺菌した。止血鉗子で腹部から毛皮を取り除いた後、75%エタノールで領域を消毒する。
腹腔を露出させるために外皮を切る。3ミリリットルの無菌RPMI 1640培地を腹部に注入する。その後、腹部をマッサージして、追加の細胞を溶液に取り外します。
胎児細胞懸濁液を15ミリリットル遠心分離チューブに吸引する。1,000gで細胞懸濁液を10分間遠心した後、上清を捨て、胎児細胞を再懸濁させて単一細胞懸濁液を得る。この手順の後、HAT培地を使用して細胞を溶解します。
細胞を数え、細胞メンバーから1ミリリットルあたり100,000にします。細胞を96ウェル細胞培養プレートに移す。プレートを一晩37度、5%の二酸化炭素でインキュベートします。
選択した免疫マウスを、75%エチルアルコールで5分間殺菌した。洗浄緩衝液としてRPMI 1640培地を吸引する。はさみを使用して皮膚と筋肉組織を取り除き、脾臓を露出させます。
ピンセットで脾臓を慎重に分離します。次いで、脾臓をRPMI 1640で洗浄する。脾臓を分離し、粉々に切ります。
ゆっくりと脾臓を叩く。次に、細胞を溶解させて脾臓細胞懸濁液を調製するRMPI 1640培地で処理した。その後、800メッシュ細胞ストレーナーにより細胞を濾過した。
大きな組織を取り除くために慎重に脾臓を釘付け。大きな組織を避けることは、細胞の融合に影響を与えます。脾細胞懸濁液をRPMI 1640培地と共にした。
次いで、細胞懸濁液を遠心分離管に加えた。1,000gで10分間遠心分離して脾細胞を収穫する。そして上清を捨てる。
脾臓細胞は10億から100億の量であると考えられていました。培養し増幅したミエローマ細胞を培養器から取り出し、フラスコを軽く振って細胞懸濁液を得る。サスペンションはRPMIを2回行った。
脾臓細胞懸濁液と骨髄腫細胞を混合します。細胞を数え、濃度を調整します。骨髄腫細胞に対する脾臓細胞の最終的な配給は、1〜5〜1〜10である必要があります。
細胞混合物を遠心分離し、上清を除去する。50%ポリエチレングリコール溶液を1ミリリットル加え、37度で1分間軽くかき混ぜます。30秒間放置し、RPMI 1640培地を2ミリリットル加え、37度で2分間インキュベートして反応を終了します。
さらに1分間、RPMIを2ミリリットルに加えます。その後、10ミリリットルRPMI 1640に加えます。800gで10分間遠心分離機。
上清を捨て、HAT溶液を添加し、37度5%の二酸化炭素で7日間細胞を培養し続ける。7日後、96ウェルプレートの細胞上清を細胞融合後に吸引し、コーティング抗原でコーティングしたELISAプレートに添加した。37度で1時間栽培し、二次抗体を30分間加え、栽培した。
100マイクロリットルの基質溶液を加えた後。反応を停止します。マイクロプレートリーダーにELISAプレートに、エンドポイント法を用い、450ナノメートルでデータを読み取った。
450ナノメートルで吸光度を測定し、陽性ハイブリドーマをスクリーニングする。限定希釈法を用い、モノクローナルハイブリドーマを調製する。選択したハイブリドーマからHD培地を取り出した後、RPMI 1640の細胞を再中断し、それらをカウントする。
96ウェルプレートと培養で、1つの細胞、2つの細胞、および4つの細胞をRPMI 1640で希釈します。陽性のハイブリドーマから24ウェルプレート、25と75平方センチメートルのフラスコに細胞を移して栽培する。24時間マイナス80度の勾配冷却ボックスにミオドマを保管してください。
その後、長期保存のために液体窒素に移します。抗血清の抗体は間接ELISAによって決定した。マウス1〜4をナリチンBSAコンジュゲートで免疫し、免疫を行わないコントロールマウスよりも有意に高かった。
1〜5,000の滴下は十分な拡散である。ハプテンコンジュゲートの分子量は、MALDI-TOF分析により確認された。図2に示すように、BSA標準とナリジンの分子量が知られているように、ナリジンの分子がBSAと共役したことを計算し、決定することができる。
ハイブリドーマだけが生き残り、HAT選択メディアで成長することができます。7日間の増殖後、細胞培養はELISAにより試験することができる。陽性のハイブリドーマを再クローン化し、拡大した。
これらの画像は、安定したモノクローナルおよびポリクローナルハイブリドーマ細胞株の従来の結果を示す。この実験の重要なポイントは、ハプテンに特異的なmAbsをスクリーニングすることですが、キャリアタンパク質ではありません。mAbの特異性を、その他の構造的に関連する化合物の存在下で調べた。
クロス反応性を算出し、抗原に対するmAb特異性を評価した。ナリンジンの較正曲線とライナーの範囲を求めた。抗原特異的モノクローナルハイブリドーマを、長期保存のために液体窒素中に拡張および凍結保存した。
このビデオを見て、小分子化合物に対してモノクローナル抗体を生成する方法についてよく理解して下さい。だから、それだけです。あなたの見て、あなたの実験のために幸運をありがとう。
