The authors have no acknowledgements.

1.細菌懸濁液の調製： <ol><li>画線培養プレートから、無菌的に無菌の接種ループを介して適切な成長培地（ 表1）の100 mlを含む250 mlの滅菌ボトルに単一コロニーを接種します。 </li><li>定期的成長のためにチェックする、1〜2日間適切な条件（ 表1）での軌道振盪インキュベーターにボトルを置きます。 140 RPMにシェーカー速度を設定します。 </li><li>無菌的に23℃で20分間3000×gで2滅菌50mlコニカルチューブと遠心チューブに細菌懸濁液を移します。 </li><li>上清を吸引除去し、滅菌ペプトン水15mlで各細菌ペレットを再懸濁します。必要に応じて渦。 1チューブ/容器内に浮遊細菌文化を結合します。 </li><li>保存培養力価を決定するために、セクション4につき三連でストック培養物を力価。 </li><li> 4時までの2週間冷蔵77; 2°C必要になるまで。再タイター使用時の文化は、ステップ4.8を参照してください。 </li></ol> 2.血小板製品の製造： <ol><li>認定血液バンクでの標準的なアフェレーシスヒト血小板製品を収集します。 90〜360ミリリットルの容量と0.8 -3.8×10 6血小板/μlの濃度：血小板製剤は、次のコレクションの仕様を満たしている必要があります。 <ol><li>血小板製剤は、病原体低減のための前処理に2時間の最小値のため休養していることを確認してください。これら2時間攪拌することなく、血小板インキュベーターで22±2℃で製品を保管してください。 2時間後、血小板製剤は、血小板インキュベーターで22±2℃で撹拌されていることを確認。最大22時間後の収集のために製品を使用してください。 </li></ol></li><li> 3ミリリットルの注射器を使用すると、血小板製剤のpH 22Cを測定するための2ミリリットルのサンプルを削除します。製品を確実にするために、血液ガス分析装置を使用して、pHを&gt; 6.6有し。血液学的分析器を用いて血小板製剤の血小板濃度を測定するために、同じサンプルを使用してください。製品は0.80から3.8×10 6血小板/μlの回収濃度の要件を満たしていることを確認します。 </li><li>視覚的に血小板製剤の渦を評価します。製品は「0」を有する場合、製品が廃棄される渦。 </li><li>直接白色光源下で血小板バッグを持ち、簡単に血小板バッグを絞ります。視覚的に血小板サンプルの旋回パターンを観察します。以下のスケールを使用して製品をスコア。 注：2 - 正渦巻き：強いコントラストでバッグ全体を通して目に見える不均一性を渦巻きます。 1 - 中級渦巻き：一部の不均一性の可視が、唯一のいくつかの場所でとコントラストが低いです。 0 - 負渦巻き：前と血小板バッグを圧搾した後、残りの濁り均質性</li></ol> 3.リボフラビンとUVライトプロセス： <ol><li>トラン滅菌チューブドッキングデバイスを使用して、リボフラビンおよびUV光照明や収納袋に血小板製剤sfer。転送後、チューブシーラーを使用して空の血小板ユニット収集袋を取り外し、バイオハザード廃棄物として空の袋を捨てます。 </li><li>その光保護外側ラップから原液リボフラビン、500μMの35ミリリットルの袋を取り出します。治療と収納袋の入口ライン上に無菌ドックリボフラビンキット。内容は血小板ユニットに排出できるようにします。 </li><li>リボフラビンポーチ/治療およびリボフラビンポーチから設定保存用バッグを掛け、ゆっくりと治療と収納袋の外へとリボフラビンバッグに残留空気を発現します。血小板製剤の少量はまた、血小板製剤に任意の残留リボフラビンをすすぐためにリボフラビンの袋の中に表現されていることを確認します。リボフラビンおよび血小板ソリューションが戻って治療や収納袋に排出できるようにして、入口ラインをクランプ。空のリボフラビンバッグ私たちを削除チューブシーラーをるとバイオハザード廃棄物として空の袋を捨てます。 </li><li>無菌ドック照明およびストレージ袋の入口ライン上にメスシリンジコネクタと6 &quot;チューブライン。メスシリンジコネクタに（プランジャーを削除）を10 mlシリンジバレルを取り付けます。 </li><li>無菌ピペットシリンジバレルに株式細菌の5ミリリットルを追加します。入口ラインのクランプを開き、細菌が血小板製剤に排出することができます。いくつかの血小板製品を10mlのシリンジバレルに逆流することを可能にすることによって、シリンジバレルをすすぎます。 10ミリリットルのシリンジバレルを削除します。 </li><li>無菌的に30mLのシリンジを接続して、血小板製剤に混入されたストック・細菌を確実にするために、入口ポートを最低2回フラッシュします。製品が十分に混合された後、きれいな5〜10ミリリットル注射器を使用し、2ミリリットルの前処理サンプルを削除します。新しい注射器を使用すると、接種工程やサンプリングステップから導入された空気がないことを確認してください。 <ol><li>部4ごとの前処理試料を滴定。 </li></ol></li><li>処理及び貯蔵バッグから入口ラインを取り外し、製品の重量を量ります。 </li><li>照明に製品を置き、標準血小板治療を開始するために、画面上のコマンドを実行します。 <ol><li>オペレータIDに入力します。 </li><li>照明装置のプラテンにバッグを固定し、マウントします。 </li><li>バーコードリーダーまたは手動入力キーパッドのいずれかを使用して照明装置にサンプルIDを入力します。 </li><li>スキャンの製品タイプ。 </li><li>石英クランプを閉じます。 </li><li>照明装置は、自動的にエネルギーの6.24 J / mlにお届けします。典型的な処理時間は5〜10分かかります。 </li></ol></li><li>治療と収納袋のサンプル電球ラインにメスシリンジコネクタと6 &quot;チューブライン治療無菌ドックの後。製品が十分に混合されていることを確認した後、5 mlシリンジを接続し、2ミリリットル後処理サンプルを削除します。 <ol><li>後処理SAMを滴定セクション4あたりPLE。 </li></ol></li></ol> 4.細菌力価<ol><li>前処理および後処理のサンプルの力価を推定し、各サンプルの終点連続希釈を行うために必要な5 mlの希釈チューブの適切な数を準備します。無菌ペプトン水1.8 mlを必要とチューブを埋めます。 </li><li>力価が10倍連続希釈スキームを用いて、各サンプル。無菌的には、最初の希釈用チューブ（10 -1）に希釈していないサンプルから0.2ミリリットルを転送します。渦この希釈管と、次の希釈チューブに0.2ミリリットルを転送します。希釈液の必要数を介して段階希釈を続行します。 <ol><li>無菌的に転送各希釈液100μlを、適 ​​切な寒天プレート（ 表1）にメッキします。 </li></ol></li><li>滅菌細胞スプレッダーを使用して、均等に各寒天プレート上にサンプルを配布します。 </li><li> （反転して、適切な条件でプレートをインキュベート<stroNG&gt;定期的に成長するためのチェック1-2日間表1）。 </li><li> 30〜300個のコロニーを有するプレートを数えます。 300より大きいコロニーを含むプレートを（TNTC）をカウントするためには多すぎると考えられています。 30未満のコロニーを含むプレートを、定量限界（LOQ）以下であると考えられます。 </li><li>各試験サンプルの力価を計算し、CFU / mlとして結果を記録。 <ol><li> CFU / mlのを計算するには、次の式を使用します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li>最低希釈プレートにはコロニーが存在しない場合は、検出（LOD）の限界を計算するために、以下の式を使用します。 <img alt="式（2）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> と <img alt="式3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> ここで： P中の粒子のNは=最低数（CFU）自信を持って検出することができroduct。 微生物が検出されないであろうと、Pは=確率。微生物を検出する95％の信頼性のため、Pは0.05を=。 ミリリットルで、V =総生産量 プレートのV =ボリュームメッキ（ミリリットル）×希釈レベル</li></ol></li><li>ネガティブコントロールのために、2つの寒天プレートのそれぞれの上に連続希釈のために使用されるペプトン水0.5mlをプレート。サンプルをテストするのと同じプレート型を使用します。裏返し、1~2日は、定期的に成長するためにチェックするために適切な条件でプレートをインキュベートします。 <ol><li>成長がいずれかの寒天プレート上で観察されている場合は、使用ペプトン水のボトルを廃棄しなければなりません。この研究の結果はまた、無効化されています。 </li></ol></li><li>陽性コントロール、再タイターを使用した細菌の保存培養のために。裏返し、1~2日は、定期的に成長するためにチェックするために適切な条件で培養します。力価は、レコードの1.0ログCFU / mlの±でなければなりません有効と見なされるための研究のために（1.5節を参照してください）​​株式価を編。 </li></ol>

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この論文のすべての著者は、現在テルモBCT、ミラソルPRTシステムの開発メーカーで採用されています。このビデオ記事の出版料はテルモBCTによって支払われています。

細菌スクリーニングは、血液金融機関で一般的になってきているし、多くの場所のためには、細菌汚染された血小板の輸血を防止するための主な方法として機能します。細菌のスクリーニングは、一般的に、Sのような急成長中のグラム陰性菌の大部分をinterdictsが、 マルセッセンス、E。大腸菌およびE.クロアカ 、それは 、Sのような成長の遅いグラム陽性菌を検出するのに苦労黄色ブドウ球菌 、 連鎖球菌属および S. 表皮8。残念ながら、これらの3グラム陽性細菌は、すべての汚染された血小板単位の50％の上方に関与していると、これら三つの生物を含む血小板製剤の輸血は、患者の死亡率1につながりました。 細菌のスクリーニングは、少なくとも一つの生物は、典型的な4-8 mlのスクリーニング試料内に含まれるように十分に十分に高いことが血小板製剤中の細​​菌力価に依存しています。細菌は、4-8 mlのサンプル容積内に捕捉されるために、細菌力価が十分に高くない場合、ユニットは、誤って陰性としてフラグが設定され、それは輸血のために解放されます。細菌のスクリーニングに別のアプローチは、すべての血小板単位で行うことができ、かつ、非機能などの汚染生物をレンダリングすることができ積極的なプロセスを採用する可能性があります。 本研究では、細菌の高い力価は、意図的に、リボフラビンおよびUV光の病原体低減プロセスの総削減容量をテストするために血小板ユニットに添加しました。この研究で試験された細菌の負荷がはるかに寄付する際に、通常の血液製品に見られるものを超えているが、この研究では、リボフラビンおよびUV光処理が著しくによって汚染血小板ユニット内生菌の力価を低下させることができることを実証するのに役立ち2.6 5.4ログ（細菌汚染の99.7から99.9996まで％減少）（ 図2）。 ACCURAを取得するにはTE対数減少値は、細菌力価の手順を実行する際に、オペレータが正確なピペッティングのスキルと一緒に良い無菌技術を持っていることが重要です。連続希釈液を実施不正確なピペッティングは、誤差の蓄積、したがって、不正確な力価測定につながることができます。 この研究で収集されたデータは、低レベルに対してシステムに挑戦リボフラビンおよびUV光で前の仕事、臨床的に関連する菌血症（&lt;20 CFU /ユニット）をサポートしています。以前の研究は、実際の臨床汚染事象を模倣するように設計され、その結果は、リボフラビンおよびUV光を7日間血小板保存期間にわたって細菌増殖を防ぐのに有効であったが示されました。以前の研究からのデータに基づいてモデル化は、血小板生成物の細菌汚染の現在のリスク推定値は、現在のレベルが8からできるだけ多く98％削減することができることを示唆しています。リボフラビンおよびUV光プロセスは、細菌の画面に匹敵します臨床的に関連する細菌負荷8でチャレンジしたときにのみ血小板単位の細菌の汚染物質を検出するために、66％の有効性を示している、る。 全ての技術と同様に、細菌で汚染された血小板ユニットに関連した合併症を防止するための血小板製剤のPRT処理は限界があります。 PRTシステムは、細菌胞子に対して有効ではなく、PRTシステムは残りのエンドトキシンがまだ受信者に敗血症性ショックを引き起こす可能性がグラム陰性菌の高力価を不活性化することができるので、場合でも、エンドトキシンを不活性化しません。細菌が高力価に伝播することができる前に、PRTは、最適なストレージの初期に行われています。 結論として、これらの二つの試験の組み合わせによって示されるように、リボフラビンおよびUV光処理の両方、グラム陰性およびグラム陽性生物の細菌負荷を減少させるのに有効であり、細菌のスクリーニングの実行可能な代替案を提供することができます。定期treatinリボフラビンおよびUV光でグラム血小板製剤はまた、ウイルスや寄生虫のような他の血液由来の薬剤の潜在的な伝達を低減させる付加的な利点を持っています。

血小板、血漿、濃厚赤血球、全血液製剤の輸血は、現代医学に大きな役割を果たしていると、様々な医学的状態を処置するための重要な流体を交換し、最終的には命を救うために使用することができます。血小板は、どちらかの全血から単離され、輸血投与量にプール又は血小板アフェレーシスの過程で収集されている細胞の産物です。体内の血小板の主な役割は、創傷部位での出血を停止し、止血を維持するのを助けるためにあります。低い血小板細胞数（血小板減少症）に罹患している患者は、自発的な出血事象に感受性であり、それらの血小板細胞は正常範囲内に戻ってカウントをもたらすために血小板と輸血されます。収集された血小板は、5-7日の最大のために保存され、一定の攪拌下にしながら、22±2℃で保存されています。 血小板輸血の救命性質にもかかわらず、そこに共同による輸血レシピエントへのわずかなリスクのまま寄生虫、細菌やウイルス11でこれらの製品のntamination。ウイルス核酸検査（NAT）の実装を大幅にそのようなC型肝炎ウイルス（HCV）、B型肝炎ウイルス（HBV）およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）5などの主要な血液媒介剤のウイルス伝播の危険性を減少しました。カナダ血液サービスからの最近の刊行物は、これらの薬剤は、HBV 15 170万の寄付につき670万HCVの寄付や1あたりHIV、1のための100万8あたり寄付されるようにするための残存リスクを推定します。 細菌は、通常、一般の人々にあまり注目を集めるものの、血小板製剤中の細菌汚染の頻度は1と高いと推定されている：1,000 7および血小板製品の何百万人が毎年輸血されているため、多数の受信者は、合併症を脅かす潜在的に生命にさらされています敗血症6のように。研究では、一度に細菌負荷ことを示唆しています汚染が低いの、&lt;100コロニー形成単位（CFU）/製品2,16は、しかし 、栄養豊富な環境と室温保存は輸血前に危険な高力価に増殖する細菌を汚染することができます。現在、血小板の受信者に届くの細菌汚染された製品を防ぐために利用可能な唯一の承認された方法は、文化ベースのシステムとケア検査の迅速なポイントを使用することです。簡単に述べると、培養ベースのシステムのための血小板製剤は、4-8 mlのサンプルを瓶に血小板生成物から除去し、接種された際に細菌が、製品中で増殖することができるように、12-24時間、22℃で攪拌機に保存されています栄養培地を含みます。ボトルは、細菌の増殖のためのボトルを監視する機器内に配置されます。器具はボトル内細菌増殖を検出した場合には、フラグが設定され、対応する血小板ユニットは破棄されます。このプロセスは、高速GROを検出することを合理的に成功しているが翼の生物は、成長の遅い種の多くは、このように輸血7,12,14,16,22のためにリリースされる偽陰性ユニットの可能性を作成し、検出することが十分に高い力価に成長しません。細菌負荷が有意に増加した場合、培養ベースの検出システムとは異なり、医療検査の迅速な点は、典型的には、血小板の保存期間後に行われます。ケア検査のポイントは文化ベースのシステムよりも敏感であり、彼らは力価に達するとだけ確実に細菌を検出≥1×10 3 CFU / mlの17以来、高い力価が必要です。しかし、そのようなテストは、サンプリングの1時間以内に結果を提供することができます。これらのテストの性能の変動は、受信者9で致命的な敗血症反応を引き起こし、偽陰性製品のリリースにつながっています。 血小板製剤の細菌汚染の問題に対処する別の方法は、病原体低減のprocの日常使用によるものです汚染細菌を不活性化する代わりに、それらを検出しようとすることができESS。 UV光との組み合わせで、光増感剤としてリボフラビン用いて、細菌3,4,8,10,19-21リボフラビンおよびUVの【選択使用を含む、病原性の血液由来の汚染物質の広範囲の感染性を減少させることが示されています病原体低減のための光は、非毒性および非変異であり、リボフラビンおよびUV光で処理されたコンポーネントは、輸血レシピエントのためだけでなく、血液製剤18を扱う人のために安全であることが示されています。簡単に言えば、リボフラビン分子は、細菌、寄生虫、ウイルス、および任意の有核細胞（ 例えば、白血球）の核酸（DNA及びRNA）と結合することができます。 UV光への曝露は、このように複製および/ ​​または核酸の転写を防止し、13を不活性化生物を残して、核酸（主にグアニン塩基）の官能基に化学的変化を引き起こし、リボフラビンを活性化します。プレートなどの無核細胞でき及び赤血球を伴う核酸の欠如にリボフラビン化学により影響されません。 リボフラビンおよびUV光技術による以前の研究は、臨床的に関連する細菌負荷（&lt;20 CFU /製品）8で汚染された血小板製剤を模倣することを目的と実験計画を用いて細菌の選択グループを評価しました。この研究の目的は、高い力価の細菌汚染に対するリボフラビンおよびUV光のプロセスを評価することであった（&gt; 1.0×10 5 CFU / ml）をシステムの全細菌還元能力を測定するために、プラズマで処理血小板製品。 hemovigilance研究1から収集したデータに基づいて、一般的に存在するグラム陰性およびグラム陽性生物のパネルが、本研究で評価のために選択し、以下の種含まれていました： 表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、セラチア菌、腸炎エルシニアを、ブルセラneotomae、セレウス菌（栄養型）、エシェリキア・コリ、緑膿菌や肺炎桿菌 。 B.除くすべての生物、 セレウスは 、ATCCから入手し、優先度は、血液成分から単離されていると同定された細菌株を得る上に置きました。 B.この研究でテストしたセレウスは、汚染された血小板製剤から内部で分離された臨床株です。

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&amp;bull;T diff&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Blood Gas Analyzer</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Docking Device</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Platelet Incubator</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Incubator Shaker</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>Dry Incubator</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Tubing Sealer</td><td>Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Centrifuge</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Syringe</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Dilution Tube</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Repeat Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;micro;l Filter Tip</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Disposable Serrological Pipette</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Disposable Serrological Pipette</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &amp;micro;M Riboflavin</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Peptone Water</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

細菌による血小板単位の汚染が長く、それらの供血後の保存条件に重大な輸血のリスクとして認識されています。製品は、日常的に、攪拌シェーカー上で22℃での細菌の増殖を促進することができる条件が記憶されています。血小板製剤中に導入されると考えられた細菌の総数が非常に低いが、これらの細菌は、潜在的に重篤な有害事象が生じる前輸血に非常に高い力価に増殖することができます。本研究の目的は、血小板製剤の一般的な汚染物質として同定された細菌のパネルに対してリボフラビン基づく病原体低減プロセスを評価することでした。 S.：このパネルには、以下の生物が含まれます表皮、黄色ブドウ球菌、S。ミチス、化膿レンサ球菌、S。マルセッセンス、Y。エンテロコリチカ、B。neotomae、セレウス菌、大腸菌、緑膿菌および K. ニューモニエ 。各血小板ユニットは高細菌負荷を接種し、サンプルをBを除去し、処理前後のOTH。コロニー形成アッセイは、終点希釈スキームを使用して、前処理および後処理の細菌力価を決定しました。 log減少は、治療前の力価から後処理力価を差し引いて計算しました。以下の対数減少が観察された。S.表皮 4.7ログ（99.998パーセント）、黄色ブドウ球菌 4.8ログ（99.998パーセント）、Sは 3.7ログ（99.98パーセント） ミチス、化膿連鎖球菌 2.6ログ（99.7％）、S。マルセッセンス 4.0ログ（99.99％）、Y。エンテロコリチカ 3.3ログ（99.95％）、B。neotomae 5.4ログ（99.9996パーセント）、セレウス 2.6ログ（99.7％）、大腸菌 ≥5.4ログ（99.9996パーセント）、緑膿菌 4.7ログ（99.998パーセント） および K 。ニューモニエ 2.8ログ（99.8％）。この研究の結果は、プロセスが細菌汚染に関連した重篤な有害事象輸血のリスクを低減するのに役立つ可能性があり示唆しています。

11の異なる細菌種の減少は、リボフラビンおよびUV光ベースのPRTプロセスを使用して評価しました。これらの薬剤は、血小板製剤のより一般的な汚染物質のいくつかを表しており、5グラム陽性および6グラム陰性生物を含みます。少なくとも6つの血小板生成物は、生物ごとに評価し、各製品は、血小板生成物中の細菌の&gt; 1.0×10 5 CFU / mlの最終力価を得るために十分な細菌を接種しました。治療前のサンプルは、血小板生成物は速やかにリボフラビンおよびUVプロセスで処理した後、前処理の力価を決定するために除去しました。以下の対数減少が観察された血小板製剤の治療を以下：Sを表皮 4.7ログ（99.998パーセント）、黄色ブドウ球菌 4.8ログ（99.998パーセント）、Sは 3.7ログ（99.98パーセント） ミチス、化膿連鎖球菌 2.6ログ（99.7％）、S。マルセッセンス 4.0ログ（99.99％）、Y。エンテロコリチカ 3.3ログ（99.95％）、B。neotomae 5.4ログ（99.9996パーセント）、セレウス菌 2.6ログ（99.7％）、大腸菌 ≥5.4ログ（99.9996パーセント）、P。緑膿菌4.7ログ（99.998パーセント）と肺炎桿菌2.8ログ（99.8％）（ 図2）。リボフラビンとUVプロセスのために上述したようにすべてのユニットは、システムの仕様を満たしていました。追加の還元試験を用いて行ったS.バフィーコート由来の血小板を用いて、 化膿連鎖 。有意差は、Sの減少は観察されませんでした。アフェレーシス血小板に対する軟膜由来の血小板においてピオゲネス （データは示さず）。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> 表1：リボフラビンおよびUV光を用いて評価した細菌種の成長条件 。血小板製剤を汚染することが示されている両方のグラム陰性およびグラム陽性細菌のパネルは、この研究のために選択しました。成長条件（温度およびメディア種類）を伝播するために使用され、タイトR生物が表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> 図1：リボフラビンおよびUV光の病原体低減プロセス 。リボフラビンは、500μMの名目上の濃度で、0.9％生理食塩水に溶解しました。解決策は、接続されており、各血小板製剤中に排出滅菌しました。細菌は、各血小板ユニットに無菌的に添加し、次いでUVエネルギー（約6-10分）の6.2 J / mlで処理しました。 このインビトロで後処理血小板部が最終細菌力価を決定するためにサンプリングした研究。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> 図2：種々の細菌種の還元リボフラビンおよびUV光で処理リボフラビンおよびUV光は、血小板製剤の一般的な細菌汚染物の細菌負荷を減少させるために使用しました。ログ10減少が違いです平均前処理力価と平均後処理力価との間である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K ビュー.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

ビデオ: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the highest possible level of safety for transfusion patients, including protection from transfusion transmitted diseases. This must be accomplished in a fiscally responsible manner which minimizes operating expenses including consumables, equipment, waste, and personnel costs, among others.
Several methods are available to produce platelet concentrates for transfusion. One of the most common is the buffy coat method in which a single therapeutic platelet unit (&ge; 2.0 x1011 platelets per unit or per local regulations) is prepared by pooling the buffy coat layer from up to six whole blood donations. A procedure for producing "double dose" whole blood derived platelets has only recently been developed.
Presented here is a novel method for preparing double dose whole blood derived platelet concentrates from pools of 7 buffy coats and subsequently treating the double dose units with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. INTERCEPT was developed to inactivate viruses, bacteria, parasites, and contaminating donor white cells which may be present in donated blood. Pairing INTERCEPT with the double dose buffy coat method by utilizing the INTERCEPT Processing Set with Dual Storage Containers (the "DS set"), allows blood centers to treat each of their double dose units in a single pathogen inactivation processing set, thereby maximizing patient safety while minimizing costs. The double dose buffy coat method requires fewer buffy coats and reduces the use of consumables by up to 50% (e.g. pooling sets, filter sets, platelet additive solution, and sterile connection wafers) compared to preparation and treatment of single dose buffy coat platelet units. Other cost savings include less waste, less equipment maintenance, lower power requirements, reduced personnel time, and lower collection cost compared to the apheresis technique.

This article describes the process used by &#214;rebro University Hospital to produce double dose buffy coat platelet concentrates prepared from whole blood donations and treated with the INTERCEPT Blood System for pathogen inactivation. The in vitro quality of the final platelet units are evaluated over 7 days of storage.

準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

Blood centers are faced with many challenges including maximizing production yield from the blood product donations they receive as well as ensuring the ...

医学

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP：準備と<em&gt;インビトロ</emPRPの&gt;抗菌特性

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

免疫・感染学

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

生物工学

LED-Based In Vitro Screening for Assessing Photoactivable Molecules in Bacterial Photodynamic Inactivation

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic inactivation of bacteria (aPDI). This process involves the administration of a photosensitizer (PS) activated by a suitable visible light source, producing exacerbated levels of reactive oxygen species (ROS) that damage crucial cellular biomolecules, ultimately causing bacterial cell death. It is crucial to create standardized, easy-to-use, and reproducible initial tests to assess and compare the effectiveness of light-induced phototoxicity of potential photosensitizers. This study introduces a simple and efficient in vitro technique for assessing photodynamic activity against planktonic bacterial cells. By employing a 96-well microplate format along with a large LED panel, the system facilitates the systematic evaluation of various compounds. Such a configuration allows for high-throughput screening of potential photosensitizers in a controlled and consistent environment, simplifying the process of identifying promising candidates for further development. This flexible platform serves as an important step in advancing the development of innovative photodynamic therapies for managing antibiotic-resistant infections.

This protocol describes a straightforward and economical method for evaluating the effectiveness of potential photosensitizers in antibacterial photodynamic inactivation (aPDI), using a 96-well plate format combined with an LED panel light source. This approach enables the simultaneous testing of multiple experimental conditions, including different concentrations, compounds, and bacterial strains.

細菌の光力学的不活性化における光活性分子を評価するためのLEDベース In Vitro スクリーニング

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic ...

生化学

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

規制カンジダバイオ フィルムの成長する赤い光で毎日光線

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, mouth, vagina, and skin. Despite the availability of antifungal medication, the mortality rate of invasive candidiasis remains ~50%. Unfortunately, the incidence of drug-resistant C. albicans is increasing globally. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer an alternative or adjuvant treatment to inhibit C. albicans biofilm formation and overcome drug resistance. Rose bengal (RB)-mediated aPDT has shown effective cell killing of bacteria and C. albicans. In this study, the efficacy of RB-aPDT on multidrug-resistant C. albicans is described. A homemade green light-emitting diode (LED) light source is designed to align with the center of a well of a 96-well plate. The yeasts were incubated in the wells with different concentrations of RB and illuminated with varying fluences of green light. The killing effects were analyzed by the plate dilution method. With an optimal combination of light and RB, 3-log growth inhibition was achieved. It was concluded that RB-aPDT might potentially inhibit drug-resistant C. albicans.

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

The growing incidence of drug-resistant Candida albicans is a serious health issue worldwide. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) may offer a strategy to fight against drug-resistant fungal infections. The present protocol describes Rose bengal-mediated aPDT efficacy on a multidrug-resistant C. albicans strain in vitro.

カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to eradicate not only due to the emergence of antibiotic-resistant strains but also its ability to form biofilms. Recently, photodynamic therapy (PDT) has been indicated as one of the potential treatments for controlling biofilm infections. However, further studies are required to improve our knowledge of its effect on bacterial biofilms, as well as the underlying mechanisms. This manuscript describes an in vitro model of PDT with 5-aminolevulinic acid (5-ALA), a precursor of the actual photosensitizer, protoporphyrin IX (PpIX). Briefly, mature S. aureus biofilms were incubated with ALA and then exposed to light. Subsequently, the antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilm was quantified by calculating the colony forming units (CFUs) and visualized by viability fluorescent staining via confocal laser scanning microscopy (CLSM). Representative results demonstrated a strong antibacterial effect of ALA-PDT on S. aureus biofilms. This protocol is simple and can be used to develop an in vitro model to study the treatment of S. aureus biofilms with ALA-PDT. In the future, it could also be referenced in PDT studies utilizing other photosensitizers for different bacterial strains with minimal adjustments.

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

This manuscript describes a protocol to study the antimicrobial effect of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (ALA-PDT) on a Staphylococcus aureus biofilm. This protocol can be used to develop an in vitro model to study the treatment of bacterial biofilms with PDT in the future.

黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>血小板ホスファチジルセリンと微小胞放出の分析

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and releasing PS-expressing microvesicles that retain the original membrane architecture and cytoplasmic components of their originating cells. The accessibility of phosphatidylserine facilitates the binding of major coagulation factors, significantly amplifying the catalytic efficiency of coagulation enzymes, while microvesicle release acts as a pivotal mediator of intercellular signaling. Procoagulant platelets play a crucial role in clot stabilization during hemostasis, and their increased proportion in the bloodstream correlates with an increased risk of thrombosis. It has also been shown that platelet microvesicles are rich in growth factors that promote wound healing and inflammatory modulation. Analyzing phosphatidylserine exposure and microvesicle release using flow cytometry poses significant challenges due to their small size and the limited number of positive events for markers of interest. Despite considerable advances in the last decade, methods for assessing phosphatidylserine exposure and microvesicle release remain a work in progress. Unfortunately, no single universally applicable protocol exists, and several factors must be evaluated to determine the most appropriate methodology for each specific application. Here, we describe a detailed protocol for isolating washed platelets from human blood, followed by collagen and/or thrombin activation, to measure the exposure of phosphatidylserine and microvesicle release that characterize procoagulant platelets. This protocol is designed to facilitate the initial preparation of platelet-rich plasma and the isolation of washed platelets. Finally, phosphatidylserine exposure and microvesicle release are quantified by flow cytometry, enabling the identification of procoagulant platelets.

<meta charset="utf8"></head><body>ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

Procoagulant platelet formation has been correlated with an increased risk of thrombosis. Presented here is a precise protocol for isolating washed platelets from human blood, intended to quantify the exposure of phosphatidylserine and microvesicle release, which are distinctive features of procoagulant platelets.

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

要約

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この動画の章

準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP：準備と

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

細菌の光力学的不活性化における光活性分子を評価するためのLEDベース In Vitro スクリーニング

規制カンジダバイオフィルムの成長する赤い光で毎日光線

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解による病原体の不活化

カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法

黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

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準備とINTERCEPT血液系を使用してDouble線量バフィーコート血小板製剤の病原体不活化

感染を防ぐための新しいアプローチとして、PRP：準備と

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

細菌の光力学的不活性化における光活性分子を評価するためのLEDベース In Vitro スクリーニング

規制カンジダバイオ フィルムの成長する赤い光で毎日光線

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法

黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

規制カンジダバイオフィルムの成長する赤い光で毎日光線

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解による病原体の不活化

黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル