この方法は、白血球がどのように活性化され、個々のアレルゲンに対するアレルギーがどのように発症するかなど、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この堅牢で再現可能なアレルギーマウスモデルの主な利点は、実験集団でより低い分散を生み出すために使用できるマウスが少ないことである。免疫応答を制御する新しい免疫療法は、生体内での有効性をテストする最初の手段として堅牢なマウスモデルを必要とします。
したがって、この技術の意味はアレルギー免疫療法にまで及ぶ。この方法はアレルギーに関する洞察を提供することができますが、望ましくない抗体応答が病気の重要な役割を果たす自己免疫などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、リポソームナノ粒子を扱う経験の欠如やマウスの仕事に必要な技術の未熟さのために苦労します。
まず、タンパク質に2.5モル相当のヘテロビ官クロスリンカーを添加し、室温で振動シェーカーに約1時間反応を置きます。SPDPで1時間のインキュベーションを行った後、酢酸ナトリウム100ミリモルで平衡化されたカラム上のタンパク質を脱塩し、画分を回収する。280ナノメートルの吸光度を決定し、上部の分数をプールします。
PBSでカラムを洗浄し、25ミリモルジチオトレイトール(DTT)をプールしたタンパク質画分に5〜10分間インキュベーションで加えます。次に、タンパク質の280および343ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質とリンカーのモル度に基づいて結合比を計算することを可能にする。次に、PBS洗浄カラムのプールされた分数を実行し、実証したように280ナノメートルおよびトップフラクションプールの測定のための画分を収集する。
100x DSPE-PEG2000-マレイミドの適切な体積をタンパク質に加えて、穏やかな渦巻きで1倍、10倍のモル過剰最終濃度を達成します。その後、密閉された丸底フラスコで窒素の下で一晩反応を実行します。翌日、架橋されたデキストランゲルビーズカラム上でタンパク質を実行し、脂質結合タンパク質の最終的なプールされた分画を使用するまで摂氏4度で保存します。
各脂質の正しい量を計算したら、すべての脂質を12ミリリットルのホウケイ酸ガラス試験管に組み合わせ、3ミリリットルのシリンジとチューブを使用してクロロホルムを窒素で慎重に吹き飛ばします。次いで、一晩100マイクロリットルのDMSOで溶液を凍結乾燥する。翌朝、12ミリリットルの脂質チューブに脂質結合タンパク質を1ミリリットル加え、超音波処理の間に少なくとも5分間の休息を伴う超音波水浴で超音波処理ごとに30〜60秒間溶液を3〜4回超音波処理します。
最後の超音波処理の後、押出機に配置された押出シリンジの1つにサンプルをロードし、押出機の反対側に押出機の注射器を置きます。空のシリンジは、ポリカーボネート0.8マイクロメートル膜を通して脂質が押し出されると充填されます。完全に組み立てた押出機を加熱ブロックに入れ、プランジャーを軽く押してシリンジを空にします。
最後の押し出しの後、リポソームをきれいなバイアルに移し、ちょうど実証したようにポリカーボネート0.2と0.1マイクロメートルの膜を通して脂質を押し出す。その後、リポソームを摂氏4度で保存します。抗原性リポソーム活性化に対するB細胞応答をモニタリングするために、カルシウムフラックスローディングバッファー内の第7スプレノサイトに1.5回10回再懸濁し、細胞に1.5マイクロモルIndo-1を加え、チューブ内の溶液を数回反転させて混合する。
光から保護された37°Cで30分間の水浴インキュベーションの後、カルシウムフラックスローディングバッファの5倍の体積を加え、Indo-1標識細胞を遠心分離します。B細胞格下げの場合、抗CD5および抗B220抗体を有する染色細胞は、0.5ミリリットルの摂氏4度で20分間、光から保護された。インキュベーションの終わりに、新鮮なカルシウムフラックスローディングバッファーで細胞を洗浄し、ペレットを氷上に保存するための新鮮なカルシウムフラックスランニングバッファーのミリリットル当たり1〜2倍の細胞に再懸濁し、分析まで光から保護する。
次に、キャップ付き、5ミリリットル、ラウンドボトム、ポリスチレンチューブに0.5ミリリットルの細胞を加え、水浴でセルを摂氏37度に温めます。3~5分後、再循環水浴に接続された37°Cのウォータージャケットチャンバーにチューブを移し、フローサイトメーターのウォータージャケットでチューブを実行します。1秒あたり5,000~10,000個のイベントを収集した後、細胞を15~30秒間安定させ、データ取得を再開し、少なくとも10秒間データを収集してバックグラウンド読み取りを確立します。
10秒のマークで、フローサイトメーターからチューブを素早く取り出し、抗原リポソームの適切な実験濃度を加える。次いで、細胞をパルス渦、さらに3〜5分間細胞計上の管を読み取る。動物を感作するには、コレラ毒素を含むピーナッツ抽出物200マイクロリットルを経口ギャベージを介して、週に1回4〜5週齢のBALB/c雌マウスレシピエントに3週間、第4週に希釈ピーナッツ抽出物300マイクロリットルを送達する。
28日目に、PBS中の1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度にピーナッツ抽出物を調製し、直腸温度計を使用して各感作動物のベースライン体温を測定する。全ての温度を測定したら、腹腔内注射を介して各レシピエントに200マイクロリットルのピーナッツ抽出物を投与し、注射後1時間毎に直腸温度計で体温を15分ごとに測定する。体温の低下はピーナッツに対するアレルギーを示す。
ピーナッツアレルギーマウスから脾細胞を単離した後、27ゲージ、5/8インチの針を備えた1ミリリットルのインスリン注射器を使用して、抽出されたアレルギー性脾細胞の7番目の10~7分の1をナイーブで無感覚化した動物の尾静脈に静脈内注射する。養子転写の翌日、アレルギー性脾細胞を受けた各BALB/cマウスの尾静脈にAra h2抗原性リポソーム200マイクロリットルを静脈内に注入する。リポソーム注射の2週間後、i.p.でマウスを高める。
可溶性のAra h 2の注射、61日目に200マイクロリットルAra h 2チャレンジが続いた。次に、示されているように、直腸プローブで体温を15分ごとに測定します。タンパク質の共役は、非共役タンパク質と比較して分子量の増加を示す還元ゲルを実行することによって実証できる。
抗原リポソーム刺激B細胞カルシウムフラックスを評価するために、生きた単一細胞をゲートしてB220陽性CD5陰性B細胞の選択を可能にする。時間の経過に及ぶIndo-1バイオレット対Indo-1ブルー蛍光の比を分析し、リポソーム誘導B細胞活性化の量を評価することができる。ELISAによるピーナッツ抽出物感作マウスの血清中のAra h 2特異的IgEおよびIgG1の定量化は、Ara h 2でブーストされた感受性を有するマウスが血清中に測定可能なAra h 2特異的IgEおよびIgG1を示すことを示している。
Ara h 2の挑戦の間に記録された体温は、アレルギーマウスが挑戦後の体温の低下を示し、ナイーブマウスの体温は一貫していることを明らかにする。この手順を試みる間、タンパク質が多すぎると押出しが困難になる可能性がありますので、リポソームに組み込まれる脂質結合タンパク質の量を慎重に追跡することが重要です。この手順に従って、アレルゲン特異的BおよびT細胞の追跡および並べ替えのような他の方法を実行して、これらのアレルゲン特異的細胞が治療にどのように反応するかについての追加の質問に答えることができる。
この技術は、アレルギー分野の研究者がこのマウスモデルを使用してアレルギー疾患と闘う新しい免疫療法を探求する道を開くでしょう。コレラ毒素を使用すると危険であり、その使用のためのガイドラインは、あなたの地元の制度的生物学的安全基準に従う必要があることを忘れないでください.
