Name: paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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この作品は、NSF のキャリア賞を受賞 1553023 と NIH/NIAID 賞 R01AI103369 によって支持されました。

1. 緑膿菌コロニー バイオ フィルムの成長
<ol><li>中二層プレートの準備<ol>
<li>トリプトン 10 g/L、寒天 10 g/L を準備脱イオン水 (材料の表を参照) ソリューション。</li>
		<li>水浴中で 20 分 50-60 ° C に涼しいオートクレーブ。</li>
		<li>トリプトン寒天培地溶液 45 mL を注ぎ 100 mm × 100 mm 角皿 (材料の表を参照してください) 50 mL コニカル チューブを使用します。寒天を固めるための許可 (20 ~ 30 分)。最初の層の上に 2 番目、15 mL の層を注ぐ。一晩固化させるは、糸くずのティッシュで拭くことによって必要に応じて蓋から結露を除去します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイオ フィルムのコロニー スポッティング<ol>
<li>LB 寒天培地プレート13に冷凍庫株から関心の系統を連勝し、37 ° C、80-100% の相対湿度で 12-16 時間暗闇の中で孵化させなさい。</li>
		<li>各ひずみまたは複製、LB の 2 mL を接種して 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 12-16 h のため暗闇の中でインキュベートする単一コロニーを使用します。</li>
		<li>新鮮な LB と 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 2.5-3 時間暗闇の中でインキュベートに 1: 100 希釈することによってサブカルチャーします。</li>
		<li>分光光度計を使用して光の密度を測定し、OD に細胞懸濁液を達成するために無菌の LB で調整500 nm ~ 0.5。</li>
		<li>目的のコロニーによってサイズ、(1.1 の手順で準備) 中二層板に細胞懸濁液のピペットで移しなさい 2.5-10 μ L とペトリふたを半開き直火の近く残して 〜 20 分が乾燥を促進するために乾燥するスポットを許可します。</li>
		<li>25 ° C と 80-100% の相対湿度、最大 4 日間の暗闇の中で植民地に斑点を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 固定液の作製
<ol><li>サンプルの収穫の日に固定液を準備します。37% ホルムアルデヒド (FA) を 4% の最終的な集中に 1x PBS で希釈 FA。 注意: FA は揮発性、有毒です。保護具を着用し、換気発煙のフードで働きます。</li>
	<li>使用直前に溶解 4 %l-リジン塩酸塩 50 mM L リジン塩酸の最終的な集中に室温で FA (ステップ 2.1 の準備)。</li>
</ol>3. [オプション] コロニー バイオ フィルムの中に定着剤のアプリケーションを直接します。
注: 我々 はバイオ フィルム形態最高固定前に寒天オーバーレイを追加するとき、保持されることを発見しました。ただし、この手順は、遺伝子発現に影響を及ぼす環境の変化も構成します。蛍光レポーターの発現パターンは、前述のように固定ステップは寒天で、オーバーレイの追加前に実施するため、別々 のプロトコルを使用してしたがって検証すべき。
<ol><li>固定および換気のヒューム フードでの作業の日、植民地の端、それを沈めることがなくコロニーの周囲に到達することができます周りの寒天培地の表面に直接手順 2 で準備定着剤をピペットします。多くの定着剤は完全に必要に応じてサラウンド植民地として約 500 μ L。 許可植民地および周囲の寒天に拡散して定着剤だけに適用されます。</li>
	<li>定着剤は植民地と周辺メディア、約 20-30 分に完全に吸収されているし、残留 FA は、プレートに表示されなくなります、3.1 の手順を繰り返します。植民地および周囲の寒天に拡散してこの定着剤を許可します。</li>
	<li>定着剤は完全に植民地に吸収されているし、周囲メディア手順 3.1 では、この時間を直接植民地の表面に定着剤を適用します。植民地および周囲の寒天に拡散してこの定着剤を許可するに進むステップ 4 だけ結局定着性吸収されているし、は、プレートに表示されなくなります。</li>
</ol>4. オーバーレイする植民地寒天培地
<ol><li>固定の日、脱イオン水と溶解する 10 〜 20 分間のオートクレーブで寒天液 10 g/L を準備します。50 ° C の水浴でクールします。</li>
	<li>優しく成長培地や植民地を寒天溶液 15 mL を注ぐ。5 分 (図 1 b) 室温でゲルを形成する寒天を許可します。</li>
	<li>上の 2 つの層の間に積層コロニー広場では、3 層のチャックをカットするのに鋭いかみそりの刃を使用します。各チャックは、複数のサンプルを準備する場合は、同等のサイズにカットされます。</li>
	<li>優しくコロニー含むチャックから余分な寒天を削除します。</li>
	<li>チャック (図 1) の下層から寒天培地 (植民地含む) の 2 つの上位層を持ち上げる、1 × PBS または水でヘラのフラット ヘッドを濡れている、優しく上部と下部層の間に挿入します。積層の植民地は下部層から分離する必要があります。根元から持ち上げるとき積層コロニーを歪める曲げたりしないように注意します。</li>
</ol>5. 固定
<ol><li>すぐに埋め込みカセットに積層の植民地 (すなわち、2 層チャック) を転送換気ドラフトでの作業 (材料の表を参照) の付いた耐薬品性マーキングペン。ガラス スライド メーラーに埋め込みカセットを配置 (材料の表参照) 準備手順 2.1 2.2 定着剤が含まれています。埋め込みカセット内部に閉じ込められた気泡がないかどうかを確認します。</li>
	<li>室温で暗闇で一晩固定液にサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>6. サンプル処理: バッファー洗浄、脱水、清算・浸透
<ol><li>一晩固定後サンプルを 1 h の 1x PBS で 2 回洗います。最高の結果を得るには、スピンを利用して試薬の均質化を自動化自動ティッシュ プロセッサの機能は、低設定に設定 (材料の表を参照)。プロセッサがない場合、処理は手動で実行できます。</li>
	<li>室温で 1 時間傾斜一連 1 × PBS (25%、50%、70%、95%) のエタノール (エタノール) 希釈液の脱水によるバッファー洗浄に従ってください。</li>
	<li>100% の 3 つの洗浄で脱水エタノール室温で 1 時間。</li>
	<li>100% オレンジ オイル ベース クリア エージェントの 3 つの洗浄で乾燥のサンプルをオフに (材料の表参照) 室温で 1 時間。</li>
	<li>潜入クリア サンプル 2 回溶融パラフィン ワックス (材料の表を参照)、加熱 2 時間、55˚C。</li>
</ol>7. サンプルの埋め込み
<ol><li>55 ° C に加熱溶融パラフィン ワックスとワックス金型を入力します。温水、フラット ヘラを使用すると、埋め込みカセットからワックスを金型、金型のベースに並列がチャックにかかっていることを確実に浸透したチャックをすばやく転送します。チャックに過度の圧力を適用することを避けるため。ワックス成形カスタム 3 D 印刷、または市販 (材料の表を参照)。</li>
	<li>4 ° C で一晩を固めるためのワックスを許可します。固形ワックスの成形品のサンプルは、4 ° C で不明確に保存される可能性があります。</li>
	<li>ワックスが凝固した、金型からサンプルを消費税し、かみそりの刃でサンプルの周りから余分なワックスをトリミングします。ミクロトームにクランプするために使用できるサンプルの断面、平面に平行の一方の端から拡張する余分なワックスを残す (材料の表を参照してください)。またサンプルのまわり、ワックス、約 1 mm の厚さのシースを残して、その面を滑らかに。</li>
</ol>8. 断面
<ol><li>42 ° C の水浴を加熱します。ブレードの端に垂直指向植民地の表面とミクロトームにサンプルをクランプ (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>植民地の目的の平面に到達するまで、セクションが収集されます 50 μ m 間隔で試料をトリミングします。</li>
	<li>75-80 rpm のセクショニング速度・ 6 10˚ の逃げ角設定ミクロトームを使用して 10 μ m 厚いセクションの目的の数のリボンをカットします。細い絵筆を使用して、ブレードからリボンをデタッチします。</li>
	<li>風呂の水にリボンを転送 (推奨) パスツール ピペットや鉗子の先端に水のドロップを使用して、優しく。セクションの下のトラップ空気泡を避けるために注意してください。</li>
	<li>すぐに風呂の水にスライドを挿入し、45 の角度でリボンの下に配置。</li>
	<li>つや消しラベルのすぐ下のスライドにリボンの狭い端に触れます。リボンが従う必要があります。</li>
	<li>風呂の水、水の表面に垂直になる角度を調整し、その長さに沿ってスライドに対して平らにリボンからスライドを引きます。リボンの下に余分な水分をトラップを避けてください。</li>
	<li>優しく、吸水糸くずの組織は、セクションから余分な水分を吸湿発散性にスライドを立ってください。</li>
	<li>ペーパー タオルの上にスライドを置くし、暗闇の中で一晩室温で乾燥すること。スライドは、暗闇の中で 4 ° C で不明確に保存することができます。</li>
</ol>9. 熱固定、水分補給、と取り付け
<ol><li>45 ° C に平準化されたホット プレートを加熱します。30-60 分のスライドを加熱します。ワックスなり半溶融、スライドに張りつき。</li>
	<li>ホット プレートからスライドを持ち上げてそれを置く優しく滑らかな、平準化、室内温度表面にフラットをワックス凝固 (~ 1 分) までに溶けたロウがスライドのいずれかの側にプルしないように注意を使用して。</li>
	<li>4 洗浄の洗浄の間ソリューションを削除するを Büchner 吸引を使用して 5 分ごとに、エージェントをオフにスライドをワックス脱ガラス スライド メーラーを使用して。</li>
	<li>100% で 3 回スライドを洗う 1 分の江藤。</li>
	<li>傾斜一連のエタノール (95%、70%、50%、25%) を 1 分ずつ 1x PBS で 2 つの 1 分洗浄処理の逆の順序でスライドを水分補給します。</li>
	<li>トリス緩衝取付中の各セクションをすぐにマウント (材料の表を参照) し、気泡の発生を回避する、観察を適用。一晩常温で重合するメディアをマウントを許可します。</li>
	<li>重合、一度クリアのマニキュアを使用してスライドに coverslip をシールします。密封されたスライドは、4 ° C で暗闇の中不明確に保存されるかもしれない。</li>
</ol>

<ol>
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パラフィン包埋、薄切片組織サンプルは微細形態構造のイメージングを有効にし、一般に真核生物の組織、使用、微生物サンプル8 にいくつかの成功と適用されている古典的な組織学的手法 ,9。Cryoembedding 内因性および蛍光信号の強力な保持できますが、パラフィン包埋は一般に望ましい形態16のより良い保全を提供します。この?...

ほとんど微生物バイオ フィルム フォームする能力があります、セルのコミュニティは、セルフ プロデュースの行列で一緒に開催。バイオ フィルムは、栄養素と基板の提供の様々 な体制で物理的なセットアップの多くの種類で栽培できます。再現可能な多細胞構造を生成する傾向がある特定のアッセイのバイオ フィルム形成とコミュニティまたは巨視的レベルで系統発生的に多様な種のための一般的なアーキテクチャが観察されます。微生物は雰囲気下で固体媒体の植民地で栽培される、肉眼形態はマトリックス生産能力についての情報を伝えるし、他の特徴1,2,3とよく相関します。微生物コロニーの内部アーキテクチャは、バイオ フィルムに固有の化学および生理学に関する手がかりを提供することもが特徴付けることは困難されています。細菌のコロニーに cryoembedding、セクショニングの技術の最近のアプリケーションは、画像と前例のない解像度4,5,6で特定の機能の可視化に有効にしています。しかし、動物組織を用いた研究は、パラフィン包埋 cryoembedding 7と比較されたとき形態の優れた保存を提供し、組織8,9の細菌を視覚化するために使用されていることを示しています。したがって、固定、パラフィン包埋、微生物コロニー バイオ フィルムの薄切片法にプロトコルを開発しました。ここでは、緑膿菌PA14 コロニー バイオ フィルム中薄いセクション10,11, の作製について述べるが、の細菌によって形成されるバイオ フィルムにこの手法を行ったも正常にSynxantha 緑膿菌、枯草菌、とコレラ12。
パラフィン包埋、薄切片のバイオ フィルムの簡単な論理は次のとおりです。まず、バイオ フィルムは処理の間に形態を維持する寒天の層に包まれています。第二に、包まれてバイオ架橋高分子に定着剤に沈んでいるし、形態を維持します。アルコールで脱水しより非極性溶媒でクリアし、し、液体のパラフィン ワックスを浸透させた。潜入、一度サンプルは区分のためのワックスのブロックに埋め込まれています。セクションは、カット、スライド、マウントより本来の状態に戻すために復元します。この時点から、染色したり顕微鏡分析のためのメディアをマウントで覆われています。
このプロトコルには、組織学的解析に適した微生物バイオ フィルムの薄い部分が生成されます。コロニー バイオ フィルムの部分は、このメソッドを使用して薄い切片を光学顕微鏡検査によってイメージが表示されます。バイオ フィルムの個々 の機能のために特定のメディア含む蛍光汚れに成長してまたは退避手順の (ステップ 9.5 9.6) をマウントする前にすぐに染色もできます。最後に、その場でこれらのコミュニティ内での細胞分布や遺伝子発現の報告を許可する構成または規制的に蛍光蛋白質を生成する微生物を設計することができます。コロニー バイオ フィルム深度、セル分布、マトリックス分布、成長パターン、時空間の遺伝子発現を決定するこれらのメソッドを使いました。

<table><tbody><tr><td>5 3/4&quot; Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chemically-resistant Marking Pen</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Manufacturer: Leica</td></tr><tr><td>Clear Fingernail Polish&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Manufacturer: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Manufacturer: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Embedding Mold&amp;nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D printed in-house</td></tr><tr><td>Embedding Mold (commercial)&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&amp;nbsp;</td><td>2701</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine-tipped Brush</td><td>********</td><td>********</td><td>Store bought, paint brush</td></tr><tr><td>Glass Coverslips 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glass Rehydration Mailer&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 slide mailer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Manufacturer: National Diagnostics&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Embedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Low Profile Microtome Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Manufacturer: Sturkey&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipette Tips&amp;nbsp;</td><td>See comments section</td><td>See comments section</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtome&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffin wax)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Manufacturer: McCormick Scientific&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Petri Dishes Square 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&amp;nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals&amp;nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Potassium phosphate&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Razor Blades&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Purchased from univeristy biostores&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Slide Warmer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Sodium chloride&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium phosphate&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost Histology Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Flotation Water Bath&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatic Tissue Processor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 Tissue Processor</td></tr><tr><td>Tryptone&amp;nbsp;</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Teknova&amp;nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

真核生物において広く確立された技術は、パラフィン包埋による区分します。ここでの埋め込み・灌流のパラフィン ワックスを使用してそのまま微生物コロニー バイオ フィルムの断面、固定法を実施します。コロニー バイオ フィルムで使用するためこのメソッドを適応し、我々 はその成長基板の各サンプルを維持すると、寒天オーバーレイヤーのラミネート技術を開発し、固定液にリジンを追加しました。これらの最適化は、微細形態機能のサンプルの保存/保護を向上させます。この方法で作製した試料は、薄膜の断面と光、蛍光、および透過電子顕微鏡によるイメージングに適しています。緑膿菌 synxantha 菌、枯草菌、コレラ菌のコロニー バイオ フィルムにこの手法を用いています。ディテールはこのメソッドによって生成されるサンプルでの高レベル レポーターひずみと組み合わせて工学または特定の染料の使用は生理学と微生物の開発にエキサイティングな洞察力を提供することができます。

このメソッドは、明瞭な形態学的特徴と遺伝子発現のゾーンを DIC、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡によって視覚化される前記バイオ フィルム薄いセクションを生成します。油浸対物レンズ × 40 を使用して DIC イメージングは、いくつかの形態学的特徴 (図 2 e) を表示するのに十分なことができますが、我々 はその蛍光を発見した恒常エクスプレス蛍?...

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Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

固定、パラフィン包埋、および微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面技法について述べる。作製した試料では、顕微鏡によるバイオ フィルムの基礎部分やレポーターの発現パターンを視覚化できます。

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.3K ビュー.  Columbia University. 固定、パラフィン包埋、および微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面技法について述べる。作製した試料では、顕微鏡によるバイオ フィルムの基礎部分やレポーターの発現パターンを視覚化できます。

ビデオ: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

工学

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

免疫・感染学

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

酵母のコロニーの埋め込み法

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

生物学

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

生物工学

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

光学顕微鏡で観察するための組織サンプルの作製

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Education

JoVE Science Education

基礎生物学

一般的な実験技術

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www.jove.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織保存:組織形態の研究方法

Source: Nagaraj A.S., et al., Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (2018)
The ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

がん研究

肺がん

体外研究

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app.jove.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

免疫学

免疫診断

In Vitro および In Vivo モデル

Fixation and Sectioning

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation is the wet mount, in which the specimen is placed in a drop of liquid on the slide. A liquid specimen can be directly deposited on the slide using a dropper. Solid specimens, such as skin scraping, can be placed on the slide before adding a drop of liquid to prepare the wet mount. Sometimes the liquid is simply water, but stains are often added to enhance contrast. Once the liquid has been added to the slide, a coverslip is placed on top, and the specimen is ready for examination under the microscope.
The second method of preparing specimens for light microscopy is fixation. The &#8220;fixing&#8221; of a sample refers to the process of attaching cells to a slide. Fixation is often achieved by heating (heat fixing) or chemically treating the specimen. In addition to attaching the specimen to the slide, fixation also kills microorganisms in the specimen, stopping their movement and metabolism while preserving the integrity of their cellular components for observation.
To heat-fix a sample, a thin layer of the specimen is spread on the slide (called a smear), and the slide is then briefly heated over a heat source. Chemical fixatives are often preferable to heat for tissue specimens. Chemical agents such as acetic acid, ethanol, methanol, formaldehyde (formalin), and glutaraldehyde can denature proteins, stop biochemical reactions, and stabilize cell structures in tissue samples.
In addition to fixation, staining is almost always applied to color certain features of a specimen before examining it under a light microscope. Stains, or dyes, contain salts made up of a positive ion and a negative ion. Depending on the type of dye, the positive or the negative ion may be the chromophore (the colored ion); and the other uncolored ion is called the counterion. If the chromophore is the positively charged ion, the stain is classified as a basic dye; if the negative ion is the chromophore, the stain is considered an acidic dye.
Dyes are selected for staining based on the chemical properties of the dye and the specimen being observed, which determine how the dye will interact with the specimen. In most cases, it is preferable to use a positive stain, a dye that will be absorbed by the cells or organisms being observed, adding color to objects of interest to make them stand out against the background. However, there are scenarios where it is advantageous to use a negative stain absorbed by the background but not by the cells or organisms in the specimen. Negative staining produces an outline or silhouette of the organisms against a colorful background.
Because cells typically have negatively charged cell walls, the positive chromophores in basic dyes tend to stick to the cell walls, making them positive stains. Thus, basic dyes such as basic fuchsin, crystal violet, malachite green, methylene blue, and safranin typically serve as positive stains. On the other hand, the negatively charged chromophores in acidic dyes are repelled by negatively charged cell walls, making them negative stains. Commonly used acidic dyes include acid fuchsin, eosin, and rose bengal.
Some staining techniques involve the application of only one dye to the sample; others require more than one dye. In simple staining, a single dye is used to emphasize particular structures in the specimen. A simple stain will generally make all of the organisms in a sample appear the same color, even if the sample contains more than one type of organism. In contrast, differential staining distinguishes organisms based on their interactions with multiple stains. In other words, two organisms in a differentially stained sample may appear different colors. Differential staining techniques commonly used in clinical settings include Gram staining, acid-fast staining, endospore staining, flagella staining, and capsule staining.
This text is adapted from <a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Openstax, Microbiology 2e, Section 2.4: </a><a href="https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-4-staining-microscopic-specimens">Staining microscopic specimens</a>

固定と切片化

Two basic types of preparation are used to visualize specimens with a light microscope: wet mounts and fixed specimens.
The simplest type of preparation ...

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニーバイオフィルムの薄い断面

要約

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この動画の章

透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

酵母のコロニーの埋め込み法

剛体の埋め込み固定し、ステンドグラス、全体、マイクロコンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

光学顕微鏡で観察するための組織サンプルの作製

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織保存:組織形態の研究方法

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

固定と切片化

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

要約

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透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

酵母のコロニーの埋め込み法

剛体の埋め込み固定し、ステンド グラス、全体、マイクロ コンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

光学顕微鏡で観察するための組織サンプルの作製

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織保存:組織形態の研究方法

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

固定と切片化

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニーバイオフィルムの薄い断面

剛体の埋め込み固定し、ステンドグラス、全体、マイクロコンピューター断層撮影によってセクション-無料の 3 D の組織学のためのミリ波スケール標本