이 작품은 NSF 경력 수상 1553023 및 NIH/NIAID 상 R01AI103369에 의해 지원 되었다.

1입니다. 녹 농 균 식민지 Biofilms의 성장
<ol><li>매체-Bilayer 접시의 준비<ol>
<li>10 g/L tryptone, 한 천 10 g/L를 준비 이온 물에서 ( 재료의 표참조) 솔루션.</li>
		<li>20 분 50-60 ° C에 시원한 물 욕조에 대 한 오토 클레이 브.</li>
		<li>100 mm x 100 mm 정사각형 접시에 agar tryptone 솔루션의 45 mL를 붓고 ( 재료의 표참조) 50 mL 원뿔 튜브를 사용 하 여. 공고히 한 천 수 (20 ~ 30 분). 두 번째, 15 mL 레이어의 첫 번째 레이어 위에 붓는 다. 밤새 공고히 하자, 보풀 티슈로 닦아 하 여 필요한 경우 뚜껑에서 결로 제거.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식민지 Biofilms 안보<ol>
<li>관심 종자 파운드 한 천 격판덮개13 에 냉장고 주식에서 행진 하 고 37 ° C와 80-100% 상대 습도에서 12-16 h에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>각 스트레인 또는 복제에 대 한 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 2 개 mL를 접종 하 여 37 ° C에서 12-16 h 250 rpm 동요에 대 한 어둠 속에서 품 어.</li>
		<li>서브 1: 100 파운드 신선 하 고 37 ° C에서 2.5-3 h 250 rpm에서 진동에 대 한 어둠 속에서 잠복기에 diluting 하 여 문화.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 광학 밀도 측정 하 고 살 균 파운드는 OD와 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 조정500 nm ~ 0.5의.</li>
		<li>원하는 서식 지에 따라 다릅니다 피펫으로 2.5-10 µ L (단계 1.1에서에서 준비) 매체 bilayer 플레이트에 셀 서 스 펜 션의 크기 하 고 자리 ~ 20 분 페 트리 뚜껑 열린 불꽃 근처 열려 떠나 건조 용이 하 게 수에 대 한 건조를 허용.</li>
		<li>최대 4 일 동안 어둠 속에서 25 ° C 및 80-100% 상대 습도에서 자리 식민지를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 통 솔루션의 준비
<ol><li>샘플 수확의 날에 통 솔루션을 준비 합니다. 1 x 4%의 최종 농도에 PBS에 37% 포름알데히드 (FA)를 희석 FA. 주의: FA은 휘발성과 독성이 있습니다. 보호 장비를 착용 하 고 통풍이 잘되는 증기 두건에서 작동.</li>
	<li>즉시 사용 하기 전에 분해 4% 염 산 L-리 신 FA 50mm L 리 진 HCl의 최종 농도를 실 온에서 (단계 2.1에서에서 준비).</li>
</ol>3. [옵션] 식민지 Biofilm에 정착 액의 응용 프로그램을 직접
참고: 우리는 biofilm 형태학 agar 오버레이 고정 하기 전에 추가 될 때 가장 잘 유지 되는 발견 했다. 그러나,이 단계는 또한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 환경 조건에 변화를 구성 합니다. 따라서 여기에 설명 된 대로 있는 고정 단계는 실시 한 오버레이 추가 하기 전에 별도 프로토콜을 사용 하 여 형광 기자 식 패턴에 확인 한다.
<ol><li>고정, 그리고 환기가 증기 두건에서 한 일에 식민지의 가장자리, 그것은 그것을 잠수 없이 식민지의 주변에 도달 수 있도록 주위 agar 표면에 직접 2 단계에서 준비 하는 정착 제 플라스틱. 약 500 µ L. 허용 식민지 및 주변 agar에 확산 정착 액으로 많은 정착 액 만큼은 완전히 식민지를 둘러싸고에 적용 됩니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 식민지 및 주변 미디어, 약 20-30 분에 완전히 흡수 되었으며 잔여 FA는 더 이상 접시에 표시, 단계 3.1을 반복 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액을 허용 합니다.</li>
	<li>일단은 정착 액 완전히 식민지로 흡수 되었으며 주변 미디어 반복 단계 3.1, 식민지의 표면에 직접 고정 제를 적용 합니다. 식민지와 주변 agar에 확산이 정착 액, 진행 단계 4에만 모든 후 통 흡수 되었으며 더 이상 접시에 볼 수 없습니다.</li>
</ol>4. 오버레이 Agar와 식민지
<ol><li>고정 일에는 10 g/L 이온된 물과 분해에 10-20 분 압력솥에 한 솔루션 준비. 50 ˚C에 물 욕조에 멋진.</li>
	<li>부드럽게 붓는 다 15 mL agar 솔루션의 성장 매체 및 식민지. 5 분 (그림 1B)에 대 한 실 온에서 젤을 형성 하기 위하여 한을 수 있습니다.</li>
	<li>날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 최고 2 개의 층 사이 적 층 하는 식민지와 정사각형, 3 층 척을. 여러 샘플을 준비, 각 척 비슷한 크기로 잘라는 확인 합니다.</li>
	<li>부드럽게 식민지 포함 된 척에서 과도 한을 제거 합니다.</li>
	<li>척 (그림 1C)의 아래쪽 계층에서 agar (식민지 포함)의 2 개의 상위 계층을 해제, PBS 또는 물 1 주걱의 플랫 머리 젖은 하 고 부드럽게 위쪽 및 아래쪽 레이어 사이 삽입 합니다. 적 층된 식민지 아래 계층에서 분리 해야 합니다. 조심 하지 왜곡 하거나 그것의 기초에서 그것을 해제 하는 때 적 층된 식민지를 벤드 합니다.</li>
</ol>5입니다. 고정
<ol><li>적 층된 식민지 (즉, 2 층 척) 포함 카세트로 전송 즉시 환기가 연기 후드, 작업 ( 재료의 표참조), 화학 방지 마킹 펜으로 표시. 유리 슬라이드 우편물 포함 카세트를 넣습니다 (재료의 표 참조) 포함 하는 준비 단계 2.1-2.2에서에서 정착 액. 없음 기포 포함 카세트 안에 갇혀 있다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>하룻밤 실 온에서 어둠 속에서에서 정착 액에 샘플을 품 어.</li>
</ol>6. 샘플 처리: 버퍼 세척, 탈수, 개간, 및 침투
<ol><li>야간 고정 후 샘플 1 h 1 x PBS에 두 번 세척. 최상의 결과 얻으려면 시 균질 스핀을 사용 하 여 자동화 기능 자동 조직 프로세서의 낮은 설정으로 설정 (자료의 표 참조). 없는 프로세서를 사용할 수 있는 경우 처리는 수동으로 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실 온에서 1 h 각 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%)에서 에탄올 (EtOH) 희석의 등급된 시리즈를 통해 탈수로 버퍼 세척을 따릅니다.</li>
	<li>100%의 3 개의 세척 탈수 EtOH 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>100% 오렌지 오일 기반 개간 에이전트의 세 가지 세척 탈수 샘플 취소 (재료의 표 참조) 각 실 온에서 1 h.</li>
	<li>침투 지운된 샘플 두 번와 녹은 파라핀 왁 스 ( 재료의 표참조), 55˚C, 2 h에 대 한가 열.</li>
</ol>7. 샘플 포함
<ol><li>55 ˚C를가 열 하는 녹은 파라핀 왁 스 왁 스 몰드를 채우십시오. 온수, 편평한 주걱을 사용 하 여 신속 하 게 포함 카세트의 침투 척 물림 쇠 병렬 형의 기지에 달려 있도록 왁 스 금형에 전송. 물림 쇠에 과도 한 압력을 적용 하지 마십시오. 왁 스 금형 사용자 지정 3 차원 인쇄 될 수 있습니다 또는 상용 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>4 ˚C에서 하룻밤을 강화 하기 위해 왁 스를 수 있습니다. 고체 왁 스 몰드 샘플 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>왁 스가 고형화 되 면 금형에서 샘플을 삭제할 고 면도날으로 샘플 주위에서 과잉 왁 스 손질. 두고 과잉 왁 스 샘플, 단면, 평면에 평행한의 한쪽 끝에서 연장는 톰으로 클램프 하는 데 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 또한 샘플 주위 왁 스, 약 1 m m 두께의 칼 집 두고 그 얼굴을 부드럽게.</li>
</ol>8. 단면
<ol><li>42 ˚C에 물 목욕을 열. 잎의 가장자리에 수직으로 동쪽으로 향하게 하는 식민지의 표면으로 톰으로 샘플을 클램프 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>식민지의 원하는 평면 섹션을 수집 된 것입니다 도달 했습니다 때까지 샘플 50 µ m 간격으로 잘라.</li>
	<li>10 µ m 두께 섹션 75-80 rpm의 단면 속도 6-10˚의 허가 각도를 설정 하는 톰을 사용 하 여 원하는 수의 리본을 잘라. 뾰족한 붓을 사용 하 여 잎에서 리본을 분리.</li>
	<li>부드럽게 전송 파스퇴르 피 펫 (선호) 또는 집게의 끝에 물 한 방울을 사용 하 여, 물 목욕 리본. 섹션에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
	<li>즉시 물 욕조에 슬라이드를 삽입 하 고 45˚에서 리본 메뉴 아래에 위치.</li>
	<li>슬라이드 반투명된 레이블 바로 아래에 리본의 좁은 가장자리를 터치 합니다. 리본을 준수 해야 합니다.</li>
	<li>물 목욕, 물, 표면에 수직이 되도록 각도 조정 하 고 그것의 길이 따라 슬라이드에 대 한 평면을 리본 허용에서 슬라이드를 당겨. 리본 메뉴 아래 초과 물을 트래핑 하지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게 서는 흡수 성 보풀 조직, 섹션에서 초과 물을 wicking에 슬라이드.</li>
	<li>종이 타월에 슬라이드를 어둠 속에서 하룻밤 실 온에서 건조 그것을 허용. 슬라이드는 어둠 속에서 4 ˚C에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>9. 열 고정, 재, 및 장착
<ol><li>45 ˚C를 수준별된 핫 플레이트를 열. 30-60 분에 대 한 슬라이드를 열. 왁 스 것 이다 될 세미-녹은 평평 하 게 슬라이드에 대 한.</li>
	<li>부드럽게 핫 플레이트에서 슬라이드를 올리고 누워 부드러운, 수준별, 실내 온도 표면에 평면 녹은 왁 스 왁 스 굳은 (~ 1 분) 때까지 슬라이드의 어느 사이드를 당겨 하지 않습니다 보장 하기 위해 관리 사용 하 여.</li>
	<li>세척 사이 솔루션을 제거 하는 Büchner 흡 인기를 사용 하 여 각, 5 분에 대 한 에이전트를 비운의 4 개의 세척 슬라이드 왁 스 드 유리 슬라이드 메일러를 사용 하 여.</li>
	<li>100%에 슬라이드 세 번 씻어 EtOH 1 분.</li>
	<li>각 1 x PBS에이 분 세척 뒤 1 분 (95%, 70%, 50% 및 25%)를 처리 하는 역 순서에서 에탄올의 등급 시리즈에서 슬라이드 리하이드레이션</li>
	<li>즉시 Tris 버퍼 장착 매체에 섹션을 탑재 ( 재료의 표참조) 기포의 도입을 방지 하는 coverslip 적용. 하룻밤 실 온에서 유해를 장착 중간을 수 있습니다.</li>
	<li>일단 생산, 투명 매니큐어를 사용 하 여 슬라이드에 coverslip 인감. 봉인 된 슬라이드 4 ˚C에서 어둠 속에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development.">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence.">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538 (2017).</li><li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms.">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysogeny+at+mid-twentieth+century:+P1,+P2,+and+other+experimental+systems.">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria.">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li><li>Zupan&#269;i&#269;, D., Ter&#269;elj, M., &#352;trus, B., Verani&#269;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section?.">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy.">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li><li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments:+fixation+of+pure+actin+filament+pellets.">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li><li>Blackburn, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

파라핀 포함 및 얇은 단면 조직 샘플은 고전적인 조직학 기술 마이크로 형태 구조의 이미징 수 있도록 진 핵 조직에 일반적으로 사용 되 고 약간의 성공을 함께 미생물 샘플8에 적용 된 ,9. Cryoembedding 생 및 immunofluorescent 신호의 강한 보존에 대 한 수, 파라핀 포함 바람직합니다 일반적으로 형태학16의 더 나은 보존을 제공 합니다. 이 방?...

대부분 미생물 형태 biofilms 용량을가지고, 셀의 지역 사회 자체 제작된 행렬에 의해 함께 개최. Biofilms는 영양소와 기판의 다양 한 정권으로 물리적 설정의 많은 종류에 성장 될 수 있다. Biofilm 형성에 대 한 구체적인 분석 재현성 다세포 구조, 항복 하는 경향이 그리고 일반적인 아키텍처 phylogenetically 다양 한 종 지역 사회 또는 거시적인 수준에서 관찰 된다. 미생물 고체 매체는 대기권의 밑에 식민지로 재배 되 고, 거시적인 형태학 매트릭스 생산 용량에 대 한 정보를 전달 하 고 종종 다른 특성 1,2,3와 상관 관계가. 미생물 식민지의 내부 아키텍처 biofilm 특정 화학 및 생리학에 대 한 단서를 제공할 수도 있습니다 하지만 특성화 하는 어려운 되었습니다. 세균성 식민지를 cryoembedding 및 cryosectioning 기술의 최근 응용 프로그램 이미징 및 시각화 전례 없는 해상도 4,,56에서 특정 기능을 활성화 했습니다. 그러나, 동물 조직으로 연구는 파라핀 포함 형태 cryoembedding 7 에 비해 뛰어난 보존 하며 조직을 8,9에서 박테리아를 시각화 하는 데 사용 되었습니다 나타났습니다. 우리는 따라서 기정, 파라핀 포함, 그리고 미생물 식민지 biofilms의 얇은 단면에 대 한 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 녹 농 균 PA14 식민지 biofilm 얇은 섹션 10,11, 준비 설명 합니다 하지만 우리 박테리아에 의해 형성 된 biofilms에 또한 성공적으로이 기술을 적용 된 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae12.
파라핀 포함 및 얇은 단면 biofilms의 과정에는 간단한 논리를 다음과 같습니다. 먼저,는 biofilms는 처리 하는 동안 형태를 보존 하는 agar의 레이어 쌌 다. 둘째, 쌌 다 biofilms crosslink 고분자에는 정착 액에 잠긴, micromorphology를 유지. 이 알코올 탈수 한 다음, 더 비 극 지 용 매로 지워지고 액체 파라핀 왁 스와 함께 침투. 침투, 일단 샘플 단면에 대 한 왁 스 블록에 포함 됩니다. 섹션은, 슬라이드에 잘라내어 다음 그들을 원래의 상태로 돌아가도록 rehydrated. 이 시점에서 그들은 수 수 스테인드 또는 현미경 분석에 대 한 설치 매체에서.
이 프로토콜 조직학 분석을 위한 적합 한 미생물 biofilms의 얇은 섹션을 생성합니다. 이 메서드를 사용 하 여 준비 하는 얇은 단면도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 군데 식민지 biofilm 콘텐츠의 표시 됩니다. Biofilms 또한 개별 기능에 대 한 특정 미디어 포함 형광 얼룩에 성장 하거나 재 단계 장착 (9.5-9.6 단계) 직전에서 스테인드 수 있습니다. 마지막으로, 미생물이 지역이 사회 내에서 셀 배포 또는 유전자 표현의 보고 제자리에 있도록 제정 또는 레 귤 레이트 된 패션에 형광 단백질을 생산 하기 위해 설계 될 수 있다. 식민지 biofilm 깊이, 셀 유통, 매트릭스 유통, 성장 패턴 및 spatiotemporal 유전자 발현을 확인 하기 위해 이러한 방법을 사용 했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">5 3/4&#34; Pasteur pipette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">13-678-6A</td>
			<td style="width:577px;">Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Agar&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Pyrex</td>
			<td style="width:161px;">5340</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chemically-resistant Marking Pen</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">103051-182</td>
			<td>Manufacturer: Leica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Clear Fingernail Polish&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Congo Red Indicator Grade</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">AAAB24310-14</td>
			<td>Manufacturer: Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Coomassie Blue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">EM-3340</td>
			<td>Manufacturer: EMD Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 247 04</td>
			<td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Embedding Mold&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>3D printed in-house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Embedding Mold (commercial)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol 200P</td>
			<td style="width:191px;">Decon Labs, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:161px;">2701</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fine-tipped Brush</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought, paint brush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Coverslips 60x22mm</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-519-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Rehydration Mailer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">21043</td>
			<td>20 slide mailer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 899 90150</td>
			<td>Manufacturer: National Diagnostics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Histosette, Embedding Casette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15 182 701A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">L-lysine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP386 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Low Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">22 210 048</td>
			<td>Manufacturer: Sturkey&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89080-004</td>
			<td>Promo-pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:191px;">See comments section</td>
			<td style="width:161px;">See comments section</td>
			<td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Microtome&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">905200U/00016050</td>
			<td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td>
			<td style="width:191px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:161px;">RSOF0010-500A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Paraplast Xtra (paraffin wax)</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">15159-486</td>
			<td>Manufacturer: McCormick Scientific&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Petri Dishes Square 100x100x15mm</td>
			<td style="width:191px;">Laboratory Disposable Products&#160;</td>
			<td style="width:161px;">D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">EMD Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:161px;">PX1405-1</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P380-500</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Razor Blades&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">55411-050</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Slide Warmer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0865259</td>
			<td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">0241-1KG</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">BDH9296.500</td>
			<td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Suprafrost Histology Slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue Flotation Water Bath&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0815797</td>
			<td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Automatic Tissue Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">813160U/Q#00009061</td>
			<td>Model: STP120 Tissue Processor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tryptone&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">T9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Y9010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

파라핀 포함 통해 단면 진 핵 시스템에는 광범위 하 게 설립된 기술입니다. 여기 제공 하는 고정 하는 방법 포함, 끼얹는다 파라핀 왁 스를 사용 하 여 그대로 미생물 식민지 biofilms의 단면. 식민지 biofilms에 사용 하기 위해이 메서드를 적용 하 우리 각 샘플의 성장 기판에 유지 하 고 agar overlayer와 코팅 기술을 개발 하 고 리 통 솔루션에 추가. 이러한 최적화는 샘플 보존 및 micromorphological 기능의 보존을 향상 시킵니다. 이 방식으로 준비 샘플 얇은 단면 및 빛, 형광, 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 이미징 의무가 있다. 우리는 녹 농 균, 슈 도모 나 스 synxantha, 새 균의 subtilis, 및 비 브리 오 cholerae식민지 biofilms에이 기술을 적용 했습니다. 세부 사항이이 메서드에 의해 생성 된 샘플에서 볼 수의 높은 수준의 결합 기자 스트레인 엔지니어링 또는 특정 염료를 사용 하 여 생리 및 미생물 지역 사회 개발에 대 한 흥미로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이 메서드는 biofilm 얇은-섹션 점에서 뚜렷한 형태 기능 및 유전자 발현의 영역 DIC, 형광 현미경 검사 법, 그리고 가장 군데 될 수를 생성 합니다. DIC 이미징 기름 침수 목표 X 40을 사용 하 여 몇몇 형태학 상 특징 (그림 2E)를 표시 하기에 충분 한 수 있습니다, 우리는 발견 그 형광 현미경 constitutively 익스프레스 형광 단백질을 설계 하는 긴장의 향상을 ?...

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Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K 조회수.  Columbia University. 우리는 고정, 파라핀 포함, 및 미생물 식민지 biofilms 얇은 단면 기술을 설명 합니다. 준비 샘플, biofilm 구조 및 기자 식 패턴 현미경 검사 법에 의해 구상 될 수 있다.

비디오: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

인간 조혈 세포 콜로니 형성 세포 (CFC) 어세이

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

연구

면역학 및 감염병학

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis</em형광 현미경 및 유동세포계측법 사용> Biofilms

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

의 성장 결핵은 Mycobacterium Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

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파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

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