Name: combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits at JoVE

デモで助けるため支援・ カルメラ ・ ヴィターレ ・ f ・ Benfenati (Istituto イタリアーノ ・ ディ ・技術、情報技術学院) をありがちましょう。この作品は、IIT とアラコエリ サン ・ パオロ (LAC にグラント号 9734) によって賄われていた。

<ol>
	<li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing.">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252 (2015).</li><li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+loss+of+P/Q-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice.">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li><li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+postnatal+loss+of+P/Q-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy,+dyskinesia,+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations.">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li><li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+P/Q-Type+Ca2++Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity.">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs.">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li><li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC/miR-155.">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53 (2006).</li><li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348 (2011).</li><li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins.">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li><li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition.">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845 (2014).</li><li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes.">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).</li><li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels.">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li><li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2+/calmodulin-dependent+facilitation+of+P/Q-type+Ca2++channels.">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li><li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P/Q-type+channel+alpha1(2.1)+subunits:+implications+for+current+density+and+Ca2+-dependent+inactivation.">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li><li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels.">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone:+a+designer's+guide+to+potent+multi-target+RNAi.">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48 (2016).</li></ol>

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光プローブおよび興味のシナプス前遺伝子に対してミールの共発現遺伝子ノックダウンがそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を特徴付けるための強力なアプローチを提供しています。この実験の方法識別し非常に効率的なネイティブ システムの興味の遺伝子をノックダウンで選択 miRs を特徴付ける重要です。可能であれば、関心の同じ mRNA に対する 2 つ以上の独立した miRs は最終的なオフターゲット効果のコントロールに使用ください。レスキュー実験、ミール耐性遺伝子は、システムの再導入は、特異性のコントロールとして使用できます。
同じ構成要素を使用して、光を表現するプローブと、ミールは、光学的に操作されているシナプス前ニューロンのみを刺激するためできます。ために混合し、希釈の結果を起こす感染および非感染のニューロンを区別しないので、これは電気刺激で可能ではありません。光の刺激は、複数の活動電位15を引き起こすことができる、ので拡大パレット15,の19,20,21の中で、最速の光遺伝学的プローブのみを選択することが重要です。また、光刺激はシナプス前の研究の直接脱分極を誘導せず、シナプス伝達の手順の一部をバイパスするを避けるために 1 つは22を調査したいことを確保するため不可欠です。
ここで、述べたい実験的アプローチでは、並行限られた期間 (4 〜 6 ヶ月) 内の興味の複数のシナプス前遺伝子の生理学的な関連性を評価可能です。ただし、ノックダウンほとんど 100% に達することを留意することが重要です。さらに、rAAVs は初期の発達過程を調査するときに時間の制約を表す場合があります光プローブの最大のノックダウンと表現を可能にするのには、少なくとも 2 週間の表現する必要があります。シナプス前ニューロンに限るより多くの時間がかかり、条件付きのノックアウト マウスは通常結果が興味の遺伝子の削除を完了し、有効な相補的なアプローチを提供するため。
ミールの技術の特定の利点は、複数の miRs 同じプロモーターから発現できます。このプロパティは、同じミールまたは同じターゲット遺伝子に対する異なる miRs の複数のコピーを挿入することによってノックダウン効率化に主に使用されています。ただし、によってまた使用されるノックダウンする複数の遺伝子別のターゲット遺伝子7,23に対して miRs を表現します。このプロパティは、シナプス前のシグナル伝達経路を分析する複数のシナプス蛋白質の沈黙にされる可能性があります。
ここでは、我々 は急性海馬スライスにおけるシナプス前機能遺伝子の打撃の効果を特徴付ける人工 miRs で光遺伝学を組み合わせています。同様のアプローチは、操作し、プローブの体内の神経回路にも使用できます。さらに、人工 miRs と chemogenetic を組み合わせてアプローチにより、尋問の長い時間スケールの神経回路に 1 つ。

このプロトコルでは、遺伝子の打撃がそのまま神経回路内でのシナプス前機能に及ぼす影響を評価する新しいアプローチについて説明します。そのまま神経回路のシナプス前機能の調査多くのシナプス前のボタンが小さすぎるのでと遠く離れた複合分子と電気生理学的介入を許可する相馬からは困難です。RNA 干渉をノックダウン シナプス蛋白質1の強力で柔軟な手段が用意されています、このアプローチは、従来の打撃の効果を検出することは困難だからシナプス前機能を調査するため多用されていた区別しない電気刺激の操作と素朴なシナプス ボタン2。ここでは、人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法について説明-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために最近開発された光遺伝学的技術と RNA 干渉を介する。
電気生理学との組み合わせで条件付きノックアウト マウスは、シナプス蛋白質3,4の機能を調査するも使用できますが、我々 の戦略は不要開発と保守の遺伝子マウスの行を変更し、遺伝子の特定のアイソ フォームをノックダウンするも簡単に採用することができます。一般的に相対的な使用される短いヘアピン Rna (Shrna) ここを用いて、人工のミールはニューロンの打撃の主な利点を提供しています。Shrna とは異なり、彼らはポリメラーゼ II のプロモーター1の制御の下で表現できます。したがって、単一プロモーターは、ミールの蛍光レポーターと一緒にの光遺伝学的プローブ式をドライブに使用できます。このように、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV、図 1 a) の包装範囲内で構造体のサイズを維持できます。また、単一の構造と単一のプロモーターを使用はミール、光遺伝学的プローブ、固定比率で蛍光レポーターの発現できるので実験的変動を低減します。
我々 は最近5海馬におけるシナプス前性カルシウム チャネルの交互スプライシング アイソ フォームの役割を調べるにこの技術を適用されます。このような戦略は、一般的に関心の任意の脳回路他ンエに表現された蛋白質の生理学的な関連性を勉強に適用されます。

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Animal Temperature Controller with heat pad</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Brain slices Prechamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera-based imager</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&amp;trade; MP</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture reagents</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin ointment</td><td>Local pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Injection micropipettes</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Inorganic salts &amp;amp; detergents</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-creatine phosphate</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td><td>Amersham</td><td>Protran&amp;trade; 0.2 &amp;micro;m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Ocular lubricant</td><td>Local pharmacy</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate inhibitors</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&amp;trade;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone iodine</td><td>Local pharmacy</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse&lt;br/&gt; Transcription Kit</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic apparatus</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

combining optogenetics with artificial micrornas to characterize the effects of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits

このプロトコルの目的は、そのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子の打撃の効果を特徴付けるためです。我々 は人工マイクロ Rna (ミール) を結合する方法のワークフローを記述する-急性脳スライスの操作シナプス ボタンの選択的刺激を達成するために研究と RNA 干渉を介する。実験的アプローチは、単一のウイルス構造と光プローブとシナプス前遺伝子に対して人工 miR(s) の両方の式を運転する単一ニューロン固有プロモーターの使用を含みます。興味の脳の領域に注入改良ときに、表現の構成要素、捜査遺伝子の発現低下と神経細胞のみを光で刺激することが可能になります。この戦略は、開発と遺伝子組み換えマウスのメンテナンスが必要ないと原則的に適用できる他の生物と選択のすべての神経の遺伝子。最近シナプス前 P/Q 型電位依存性カルシウム チャネル (VGCCs) の代替スプライス アイソ フォームのノックダウンが CA1 急性海馬スライスにおける興奮性シナプスに CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節する方法を調査することを行った。同様のアプローチは、操作し、プローブのin vivo神経回路にも使用できます。

上記の手順は、どのようにシナプス伝達を評価する手法は、シナプス前ニューロンにおけるシナプス蛋白質の打撃によって影響を受けるを提供します。代替のノックダウン スプライスのシナプス前 Cav2.1 のアイソ フォームの代表的な結果 (P/q) VGCCs 例として下記の通り興奮性シナプス CA1 に CA3 で短期的なシナプス可塑性を調節します。
Cav2.1 (P/q) チャネルは、中枢神経系で最も速いシナプスで優勢なシナプス前 VGCCs。相互に排他的エクソンのスプライシング代替 37a と Cav2.1 (α1 a) の細孔形成 α1サブユニットの 37b 生成 2 つの主要な変形、Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb]16,17 、18。かどうか Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] 差動を調節するシナプス伝達とラット海馬錐体ニューロンのシナプス可塑性を決定する開発したノックダウンするアイソ フォーム特異 miRs 選択的に Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 [EFb]5。ショート サイズにもかかわらず (97 bp) とエクソン間類似性が高い (塩基配列レベルで id 61.86%) に対して 3 つのミール シーケンスを設計できるか 37b 37a、ラットの Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; ミール EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG;ミール EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) および 2 Cav2.1 [EFb] ラットに対して (ミール EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; ミール EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) 予測高ノックダウン効率。否定的な制御 (ミール コントロール) として、知られている脊椎動物の遺伝子をターゲットにしないシーケンスを含む pcDNA6.2 GW/EmGFP ミール neg プラスミドを使用しました。HEK 293 細胞異種チャンネルの最初の画面を基に、ミール EFa1、ミール EFa3 と EFb2 を選択しに 3' UTR の rAAVs の生産のために設計されている pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X のベクトルの式カセットを複製と場所、synapsin プロモーター ドライブ式超高速チャネルロドプシン ケータ、赤の蛍光タンパク質 TdTomato と挿入されたミール (図 1)。我々 はまた、ミール EFb2 このミールのノックダウン効率を高めるための発現カセットを複製しました。
次に、上記の 4 つの構造の rAAV1/2 を作製し、ノックダウン効率化及びアイソ フォーム特異 qRT PCR を用いたラット初代神経文化における選択性を定量化しました。ミール EFa1 とミール EFa3 ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFa] 〜 70% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFb] ながら減少ミール EFb 減少ネイティブ カリフォルニア州v2.1 [EFb] ~ 60% の mRNA はなく、Cav2.1 [EFa] (図 2)。
我々、改良 4 rAAV1/2 のそれぞれに注入 (図 3 a-c)、P18 ラットの海馬の CA3 領域 (A ・ P/M L/D-V 前から) −2.6 の座標を持つ/± 2.9/−2.9。15 から 24 日後注入 rAAV1/2 注入ラット急性海馬スライスを作製し、TdTomato 蛍光式 (図 3 b) rAAVs の局在を確認するために使用します。[EFb] Cav2.1 [EFa] または Cav2.1 のシナプス前の打撃に CA1 シナプスに CA3 における短期的なシナプスの可塑性が影響を受けるかどうか調べるために、我々 は簡単な 473 nm レーザー光パルス (2 ms 間で選択的に感染の ca3 錐体細胞を刺激;図 3) と CA1 領域 (図 3) の内側の管に近位の錐体細胞のパッチによって結果の工を記録。Cav2.1 スプライス アイソ フォームのノックダウンに反対の方向で対パルス刺激に対する応答が影響を受けることが分かった: Cav2.1 のノックダウン [EFa] (ミール EFa1 またはミール EFa3) に対しペアパルス円滑化 (PPF) を後押しした Ca のノックダウンv2.1 [EFb] (ミール EFb2) はそれ (図 3 DE) を廃止しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> 図 1: 超高速光プローブ ケータとアイソ フォーム特異 miRs Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] に対して組み合わせ式の構造の方式です。(A) 、下さい rAAV の地図作成 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X、synapsin プロモーター (Syn) を含む、超高速チャネルロドプシン ケータ融合 TdTomato し、近位 3' UTR、Cav2.1 スプライス ・ アイソ フォーム特異ミールで。表示の制限の酵素は、シングル カッターです。(B)式カセットのトップ、方式です。Synapsin のプロモーターは、ケータ TdTomato のアイソ フォーム特異 miR 式をドライブします。下、ミールのカセットの部分を形成する 21 ヌクレオチド ターゲット シーケンスの逆の補数。ミール EFb2 2 つの同一のミール カセットだった他の後タンデム 1 つで表されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> 図 2。ノックダウン効率と Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] のアイソ フォーム特異 miRs の選択性の評価します。MiRs Cav2.1 [EFa] (ミール EFa1 とミール EFa3) をターゲットを表現する rAAVs 6 DIV で感染 17 18 DIV 初代培養から分離された RNA のアイソ フォーム特異 qRT PCR 解析または Cav2.1 [EFb] (ミール EFb2)。データは、ネガティブ コントロール (ミール コントロール) に正規化されます。ミール EFa1 とミール EFa3 大幅にし、選択的に減らす [EFa] Cav2.1 の mRNA (n 8 と 7 の文化をそれぞれ =)、ミール EFb 大幅にし、選択的に減少 [EFb] Cav2.1 の mRNA (n = 4 文化; * * * p < 0.001; 一方向の解析分散テスト テューキー Kramer の事後テストが続く)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> 図 3。オプトジェネティクスをノックダウン ニューロンの刺激をターゲットの役割評価 Cav2.1 [EFa] と Cav2.1 [EFb] ネイティブ海馬。(A) 生体内で感染に使用下さい rAAV 構造の発現カセット法(B)その TdTomato 蛍光性を示す海馬のセクションは、CA3 領域とその予測に限定されます。(C)実験的構成: レーザービームが CA3 突起に指示された, CA1 錐体細胞からパッチ クランプ録音を行った。(D) 2 ms ロング ブルー (473 nm) レーザー光パルス 20 Hz で輝いていた呼び起こす工が PPF は miRs Cav2.1 [EFa] をターゲットにより増加し、ミール Cav2.1 [EFb] によって廃止されます。ミール コントロールする相対的なミール、EFb2 の減少とミール EFa3 ミール EFa1 PPF の増加を示すペアパルス比率 (D) のように実験のための(E)概要 (n = 9-11 録音; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p < 0.0004; 共分散分析)。± SEM. を意味するようにデータが表示されます。この図は、Thalhammer、A.らから適応されています。5.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA 干渉を結合する方法のワークフローを提供します。

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K ビュー.  Istituto Italiano di Tecnologia. このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA 干渉を結合する方法のワークフローを提供します。

ビデオ: Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

行動学

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

神経科学

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate new neurons, which integrate into an existing neural circuit and contribute to specific hippocampal functions. Importantly, adult neurogenesis is highly susceptible to environmental stimuli, which allows for activity-dependent regulation of various cognitive functions. A vast range of neural circuits from various brain regions orchestrates these complex cognitive functions. It is therefore important to understand how specific neural circuits regulate adult neurogenesis. Here, we describe a protocol to manipulate neural circuit activity using designer receptor exclusively activated by designer drugs (DREADDs) technology that regulates NSCs and newborn progeny in rodents. This comprehensive protocol includes stereotaxic injection of viral particles, chemogenetic stimulation of specific neural circuits, thymidine analog administration, tissue processing, immunofluorescence labeling, confocal imaging, and imaging analysis of various stages of neural precursor cells. This protocol provides detailed instructions on antigen retrieval techniques used to visualize NSCs and their progeny and describes a simple, yet effective way to modulate brain circuits using clozapine N-oxide (CNO) or CNO-containing drinking water and DREADDs-expressing viruses. The strength of this protocol lies in its adaptability to study a diverse range of neural circuits that influence adult neurogenesis derived from NSCs.

The goal of this protocol is to describe an approach for analyzing behavior of adult neural stem/progenitor cells in response to chemogenetic manipulation of a specific local neural circuit.

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats

This protocol demonstrates the steps needed to use optogenetic tools to reverse cocaine-induced plasticity at thalamo-amygdala circuits to reduce subsequent cocaine seeking behaviors in the rat. In our research, we had found that when rats self-administer intravenous cocaine paired with an audiovisual cue, synapses formed at inputs from the medial geniculate nucleus of the thalamus (MGN) onto principal neurons of the lateral amygdala (LA) become stronger as the cue-cocaine association is learned. We hypothesized that reversal of the cocaine-induced plasticity at these synapses would reduce cue-motivated cocaine seeking behavior. In order to accomplish this type of neuromodulation in vivo, we wanted to induce synaptic long-term depression (LTD), which decreases the strength of MGN-LA synapses. To this end, we used optogenetics, which allows neuromodulation of brain circuits using light. The excitatory opsin oChiEF was expressed on presynaptic MGN terminals in the LA by infusing an AAV containing oChiEF into the MGN. Optical fibers were then implanted in the LA and 473 nm laser light was pulsed at a frequency of 1 Hz for 15 minutes to induce LTD and reverse cocaine induced plasticity. This manipulation produces a long-lasting reduction in the ability of cues associated with cocaine to induce drug seeking actions.

The methods described here outline a procedure used to optogenetically reverse cocaine-induced plasticity in a behaviorally-relevant circuit in rats. Sustained low-frequency optical stimulation of thalamo-amygdala synapses induces long-term depression (LTD). In vivo optogenetically-induced LTD in cocaine-experienced rats resulted in the subsequent attenuation of cue-motivated drug seeking.

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

This protocol demonstrates the steps needed to use optogenetic tools to reverse cocaine-induced plasticity at thalamo-amygdala circuits to reduce ...

Drosophila Optogenetics: A Method to Manipulate Neuronal Circuits

Source: de Vries, S. E., Clandinin, T. <a href="https://www.jove.com/video/50192/" target="_blank">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2013).
Optogenetics enables the use of light to manipulate neurons that are genetically engineered to express specific opsins&#8211;light-sensitive proteins whose light activation triggers a change in the state of the neuron. Here we describe an optogenetic approach in Drosophila using the opsin Channelrhodopsin2. The example protocol features an optogenetics assay set to study the neuronal circuitry behind the fly&#39;s escape behavior.

ショウジョウバエオプトジェネティクス:神経回路を操作する方法

Source: de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2013).
Optogenetics enables ...

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

要約

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の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

ショウジョウバエオプトジェネティクス:神経回路を操作する方法

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

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の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

miRNAの脳特異的ノックダウンのための定位注射への単純な代替

マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

オプトジェネティクスを使用して神経可塑性を逆転させ、ラットのコカイン探索を阻害する

ショウジョウバエオプトジェネティクス:神経回路を操作する方法

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ