このプロトコルは、光遺伝学的技術の新しい進歩と薬物乱用の前臨床モデルを使用して、再発の促進に関与する神経回路の可塑性を逆転させるため、重要です。この技術の主な利点は、覚醒中の動物におけるシナプス活動の回路特異的操作を可能にすることであり、これは、将来の手がかり動機によるコカイン探索行動に対して長期的な阻害効果を有する。この方法は、行動に関連する神経可塑性を具体的に操作するために、他の多くのシステムおよび回路にわたって利用することができる。
26ゲージのステンレス鋼注射カニューレを1マイクロリットルの濃縮AAV溶液で満たされたハミルトン注射器に接続して、手術の準備を開始します。動物に麻酔をかけた後、テキスト原稿に記載されているように、手術領域を剃り、目を滑らかにして乾燥を防ぎます。次に、ラットに体重量の鎮痛剤カルプロフェンを背中上部の皮膚から皮下注射し、5ミリリットルの乳酸リンゲル液を腰部の皮膚から皮下注射する。
その後、静脈内カテーテル移植を行います。カテーテル移植直後に、ラットを定位固定装置フレームに固定し、アデノ随伴ウイルス注射を行う。頭蓋骨の上の皮膚からリドカインのボーラスを皮下注射して局所的に麻酔をかけ、頭蓋骨の前部から後部に0.5ミリメートルの切開を行います。
頭蓋骨の表面を露出させるために上にある組織を取り除きます。ラットの頭を前後軸に沿って水平にし、脳定位座標をゼロにしてブレグマに水平にし、小さなドリルビットを備えたドレメルツールを使用して頭蓋骨に3つの小さな穴を開け、ドライバーでステンレス鋼のネジを所定の位置に取り付けます。AAVの注入のために、内側の生殖器核またはMGNのためにラットブレインアトラスからの座標に基づいて両側の穴を開けます。
ブレグマに対して使用される座標は、前後軸でマイナス5.4ミリメートル、内側外側軸でマイナス3ミリメートル、背側腹軸でマイナス6.6ミリメートルです。カニューレがMGNに適切に配置されるまで、注射カニューレを毎分約4ミリメートルでゆっくりと下げ、濃縮AAV溶液を毎分0.1マイクロリットルの速度で注入します。注入が完了したら、注射カニューレを5分間そのままにして、カニューレからウイルスを拡散させてから、カニューレをゆっくりと脳から引き出します。
次に、内側膝状核外側扁桃体末端を標的とした光ファイバーの移植に進む。ドレメルツールを使用して、原稿で説明されている座標で、外側扁桃体の上に両側の穴を開けます。鉗子を使用して光ファイバーインプラントのフェルールをつかみ、フェルールを定位固定装置アダプターに固定します。
繊維の先端がLAの背側部分に位置するまで、毎分2ミリメートルの速度でゆっくりと繊維を下げます。最初にロックタイトインスタント接着剤の薄層を使用してフェルールを皮膚に固定し、次に歯科用セメントを使用します。歯科用セメントが十分に乾いたら、フェルールスリーブとダストカバーでフェルールを覆います。外科的処置の後、ラットを個別に収容し、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり5ミリグラム、ヘパリン1ミリリットルあたり30USP単位を含む生理食塩水でカテーテルを毎日洗い流します。.
行動実験開始の24時間前に、食物はラットを自由摂食体重の90%に制限します。ラットをオペラントチャンバーに入れて、コカイン1ミリリットルあたり2ミリグラムの自己投与のための毎日1時間のトレーニングセッションを、一定の比率で1スケジュールの強化の下で受けます。チャンバー内で、ラットがレバープレスできるようにします。
指定されたアクティブレバーを押すと、1キログラムあたり1ミリグラムのコカイン注入が行われ、コンパウンドライトとトーンのキューが10秒間表示されます。指定された非アクティブなレバーを押しても、プログラムされた効果はありません。ラットが3日間連続して1日あたり少なくとも8回の注入に成功するまで、少なくとも10日間自己投与実験を続けます。.
20日目までに取得基準に達しなかった場合、研究から除外されます。取得基準が正常に満たされた後、ラットがオペラントチャンバー内で自由にレバープレスできるようにすることにより、ラットを6〜10日間1時間の機器絶滅セッションにかけます。2日間連続して平均最大25回のレバープレスが発生するまで、毎日機器の消火を続けます。
長期うつ病またはLTDの光遺伝学的誘導のために、清潔で標準的なげっ歯類のハウジングケージの上に吊り下げられた回転ジョイントを介して、パッチケーブルを473ナノメートルの青色レーザーダイオードに接続します。取扱説明書に従ってレーザーの電源を入れ、レーザーをパルス発生器に接続します。設定を調整して、ラットに1ヘルツで2マイクロ秒で900パルスの光を与えます。
光センサーを使用してパッチコードを介した光出力を測定し、パッチケーブルを介した光出力が約5〜7ミリワットになるようにレーザー強度を調整します。ラットを清潔なハウジングケージに入れ、フェルールを露出させているダストカバーとフェルールスリーブを取り外します。次に、パッチコードを各フェルールに両側に接続します。
適切に設定されていれば、げっ歯類は光遺伝学的刺激中にケージの周りを自由に動き回ることができます。ラットが3分間環境を探索した後、パルス発生器をオンにして光遺伝学的刺激を開始します。長期のうつ病誘発後、ラットをケージに3分間留まらせてから、ホームケージに戻します。
in vivo光遺伝学的刺激の24時間後、ラットをオペラントコンディショニングチャンバーに戻し、コカイン探索行動を評価するために1時間の標準的な合図誘発復帰セッションを受けます。アクティブレバーを押すと、ライトとトーンのキューが10秒間表示されます。最初の検査から少なくとも1週間後に、2回目の復職試験を行い、光遺伝学的LTD誘導がコカイン探索の長期的な抑制をもたらすかどうかを判定する。
代表的な解析では、コカイン自己投与の獲得および消滅が示されている。コカイン注入と能動的レバー反応は獲得全体で増加し、非アクティブレバー反応はほとんどなかった。コカインの自己投与中、能動的反応の数は、2週目に安定する前に、各獲得日にわたって徐々に増加した。
絶滅の初日には、レバープレスの最初のブーストが観察され、その後、両方のレバーでの応答が減少しました。器械の消滅に続いて、手がかりの再導入は、アクティブなレバー反応の数の増加に代表されるコカインシークを復活させました。光学LTDは、コントロールと比較してアクティブなレバープレスの大幅な減少を引き起こしました。
7日後、ラットを再び試験した。以前にMGN-LA LTDを受けた動物は、対照と比較してアクティブなレバープレスを有意に減少させ、光学LTDがコカインシークの長期的な減少をもたらしたことが明らかになりました。Ex vivo電気生理学的記録は、光学LTDに続いて、LAニューロンにおける光学的に誘発された興奮性シナプス後電流の振幅の減少を示した。
さらに、興奮性シナプス後電位の上昇勾配は、偽刺激を受けた動物からのニューロンにおけるex vivo光刺激によって減少したが、in vivo光学LTDを有する動物からのニューロンでは減少しなかった。光ファイバーインプラントの配置とウイルス発現は、外側扁桃体とMGNで組織学的に検証されました。コカイン探索行動をうまく減らすためには、光ファイバーインプラントを通して適切な光出力を達成し、持続的な低周波刺激を使用して長期的なうつ病を促進することが重要です。
この手順に続いて、神経記録技術を使用して神経活動の変化を決定し、コカイン探索または他の学習行動の他の行動テストを実施することができます。
