Name: the mplex protocol for multi-omic analyses of soil samples
Uploaded: 2018-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples at JoVE.com

Yazarlar Nathan Johnson rakamlar hazırlarken onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma ABD Enerji Bakanlığı'nın Office biyolojik ve çevresel araştırma (genom bilim programı), Microbiomes geçiş (nane) laboratuvar yönelik araştırma geliştirme tarafından finanse Pan-omics Program tarafından desteklenmiştir Pacific Northwest National Laboratory, hem de ulusal kurumları, Sağlık Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (R01 ES022190) girişimi ve NIH (P42 ES027704). KEBJ R21 HD084788 geliştirmek ve yeni multi-omic ayıklama teknikleri doğrulamak finansal destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser içinde W. R. Wiley çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı (EMSL), DOE Ulusal bilimsel Kullanıcı olanağı Pacific Northwest Ulusal Laboratuvarı (PNNL) adlı gerçekleştirildi. PNNL için sözleşme DE-AC06-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilen bir çok program Ulusal laboratuvardır.

Not: Çok ıslak toprak çıkarma çıkarma önce zarar vermeden etkinliği için liyofilize. Islak toprak da kullanılabilir ancak reaktifler belirli oranlarıyla eklerken düşünülmelidir.
Not: Bu iki 50 mL tüpler (en fazla 50 mL tüp başına 10 g toprak) arasındaki ayırmalısınız ayıklama başına kuru toprak ağırlığının 20 g kullanmak için tavsiye edilir. Çekimi bağlıdır kullanılabilir örnek aşağı ve yukarı ölçeklendirilebilir.
Not: Kuru toprak örnekleri homojenize ve küçük kökler ve kayalar kaldırmak için 3 mm ekran üzerinden elenmiş. Örnek belgili tanımlık perde içinde sıkışmış almak gibi ıslak toprak örnekleri, elek değil.
1. hücre lizis ve metabolitleri, proteinler ve yağlar (zamanlama ~ 1 d) çıkarımı toprak
<ol><li>20 g toprak örneği 10 g metanol/kloroform uyumlu olan iki ayrı 50 mL tüpler içine tartın. Kloroform örnekleri kirletici çoğu plastik leach olarak seçilmiş, tüpleri ile son derece dikkatli olun. Her ne zaman mümkün veya plastik borular polipropilen ya da politetrafloroetilin (PTFE) yapılan cam kullanın. Not: toprak buz ve serin tutmak ilk tartı ve homojenizasyon adımları sırasında mümkün olduğunca.</li>
	<li>Paslanmaz çelik kloroform yıkanmış ve garnet boncuk 10 mL her tüp için ekleyin. Buz, soğuk ultrasaf 4 mL ekleyin ( Tablo malzemeleri arıtma sistemi için görmek) her tüp (iki tüp arasında bir örnek bölünmüş) su ve buz kovası örneklerinde duman kukuIeta aktarmak.</li>
	<li>25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, hızlı bir şekilde buz gibi 2:1 kloroform: metanol (v/v) 20 mL ekleyin. Dikkat: Kloroform: metanol akut potansiyel sağlık etkileri vardır: cilt tahriş, olası kimyasal yanık ve solunum sistemini tahriş. Böbrekler, karaciğer ve kalp etkileyebilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek ve her zaman bir duman mahallede çalışır.</li>
	<li>Kapakları ve girdap çözüm sıkın. 2:1 choloroform:methanol prokaryot hücre duvarı kırmak yardımcı olur ve aynı zamanda enzimatik faaliyetleri inaktive.</li>
	<li>Tüpler 50 mL tüp girdap ekler ve yatay olarak bir buzdolabı içinde 4 ° C'de 10 dakika için girdap mümkünse ekleyin. O zaman, onları tamamen soğuması için ~ 15 dk-80 ° C dondurucu içine örnekleri yerleştirin.</li>
	<li>Bir sonda sonicator bir duman başlık içinde kullanarak solüsyon içeren temizleyicide her örnek genlik %60 30 6 mm (1/4") prob ile her buz s. Dikkat: Bu bir ses sonicating muhafaza ve kulak koruma azalmaya kullanmak için önerilir. Yüksek gerilim güç kaynağı ve yüksek frekans kabloyu mevcuttur. Alt veya örnek gemi kenarlarında ile etkin bir soruşturma dokunmaktan kaçının; çatlamak veya plastik erime olabilir.</li>
	<li>Sonicating bir sürü ısı üretmek gibi örnekleri ~ 15 dk,-80 ° C dondurucuya koyun.</li>
	<li>1.5-1.7 adımları yineleyin. Not: örnekleri lizis yordam soğuk kalmak emin olun.</li>
	<li>4000 x g 5 min, 4 ° c için de örnekler santrifüj kapasitesi Bu noktada, örnek üst metaboliti katmanı, protein interlayer ve daha düşük lipit katmanı (ve kalan enkaz Pelet) ayrılacaktır. Bkz: Şekil 1.</li>
	<li>Buz buz kovası içinde örnekleri yerleştirin ve duman kukuIeta ve 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak içinde üst metaboliti katmanları bir büyük cam şişe iki 50 mL tüpler kaldırın. Not: herhangi bir protein tabakası pipet aspirating kaçının; metaboliti küçük tabakası bırakın.</li>
	<li>Böylece ücretsiz düşük lipit katmanı üzerinde yüzen olduğunu protein interlayer serbest bırakmak için 50 mL tüp biraz eğ. Bir temiz paslanmaz çelik düz kafalı laboratuvar spatula kullanarak, dikkatli bir şekilde protein interlayers her iki kepçe ve birlikte bir yeni 50 mL tüp içine koyun.</li>
	<li>25 mL Cam serolojik pipet kullanarak, alt lipid katmanları bir büyük cam şişe kaldırın. Not: kalkınan toprak parçacıklar kaçınıyorum; Ancak, bazı toprak enkaz ve parçacıklar ile birlikte talip lipidler daha sonra kaldırılacak.</li>
	<li>Metaboliti ve lipid tepesinden solunabilir membranlar cam şişeleri ve bir vakum yoğunlaştırıcı kuruluk kadar kuru bir yer (lipidler ~ 4-5 h, metabolitleri gecede).</li>
	<li>Protein örnek tüp ve kalan enkaz Pelet tüpler için her buz gibi metanol ve girdap 20 mL ekleyin. Bu enkaz dışında herhangi bir olası kalan protein savurma daha önce solubilize girişiminde bulunmadan önce kloroform durulama için enkaz parçaları için yapılır.</li>
	<li>Enkaz parçaları ve protein 4.000 x g 5 min, 4 ° C, için de interlayer sonra metanol tehlikeli atık konteyner içinde duman kukuIeta içine dikkatle boşaltmak santrifüj.</li>
	<li>Sıvı azot protein ve enkaz parçaları donma ve bir lyophilizer (bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C metanol-98 ° c çok düşük donma noktası olması nedeniyle yeteneğine ile) Kuru ~ 2 saat için. Not: onlar daha solubilize zor olacak gibi granül, aşırı kuru değil.</li>
	<li>Protein solubilization arabellek (%4 SDS, 100 mM DTT (DL-dithiothreitol) 50 mM tris tampon pH 8.0; bkz: Ek reaktif Set-up) 10 mL protein interlayer tüp ve 20 mL her enkaz parçaları ekleyin. Dikkat: SDS akut toksisite neden olur ve yanıcı. Cilt, göz ve hava yolu tahriş edici olduğunu. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek.</li>
	<li>Duman başlık, sonda solüsyon içeren temizleyicide örnekleri için %30 20 genlik, onları çözümü haline getirmek için s. 2 min için girdap.</li>
	<li>Protein interlayer örnek protein solubilize için bir laboratuvar tüpü rotator 300 rpm, 50 ° C'de 30 dk için içine yerleştirin.</li>
	<li>Yatay olarak girdap enkaz örnekleri için kalan sağlam hücreler, koşullar için ek bir 10 dk sonra döndürün kalan 20 dk için protein interlayer örnekleri ile.</li>
	<li>Tüm örnekleri, 4500 x g 10 dk, oda sıcaklığında (RT), santrifüj kapasitesi ve süpernatant her tüpün örnek başına iki 50 mL tüpler içine toplamak.</li>
	<li>Solubilization 10 mL protein interlayer Pelet tampon, sonra da solüsyon içeren temizleyicide ve girdap geri çözüm ve santrifüj daha önce olduğu gibi ekleyin.</li>
	<li>Supernatants iki 50 mL tüpler içine eşit birleştirmek ve 8.000 x g 10 dk, sabit açılı kova Open End 4 ° C de santrifüj kapasitesi. Not: Son Santrifüjü Aşırı bulaşıcı hümik maddelerin kaldırmak gereklidir.</li>
	<li>Böylece her 30 mL her supernatants iki 50 mL tüpler içine dikkatle boşaltmak. Ardından, bir 10 mL Cam serolojik pipet kullanarak TCA (trichloroacetic asit) 7.5 mL her tüp için ekleyin. Girdap içine çözüm. Bu % 20 yapar TCA her 30 mL örnek (buna göre ayarlayın), Dikkat: Bu TCA kostik, toksik ve Mayıs cilt yanıklara neden. Eldiven ve koruyucu gözlük giymek.</li>
	<li>Örnekleri-20 ° C-dondurucu gece 2 h için yerleştirin. Not: Proteinler genellikle içinde 1 h çökelti ama sol (en fazla 18 saat) gece olabilir. Not: 18 h protein mümkün asit hidroliz nedeniyle daha uzun süre gitmek TCA ayıklama izin vermeyin. Örnek donmuş, buz çözme; tezcan ısınmak örnek izin vermeyin.</li>
	<li>Çöktürülmüş protein cips için 4500 x g 10 dk, 4 ° C için de örnek santrifüj kapasitesi ve süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>10 mL % 100 buz gibi soğuk aseton her protein Pelet, girdap ve birleştirme parçaları gibi bir tüpün içine ekleyin.</li>
	<li>(Bir denge kullanarak) kombine Pelet içeren tüp santrifüj kapasitesi ve sonra içine atık süpernatant dikkatle boşaltmak. Dikkat: Aseton solunum yolu ve deri ve göz tahrişine neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük eldiven ve önlük giymek, duman mahallede çalışma.</li>
	<li>İki kez 1.5 mL aseton ve son olarak 2 mL tüp 10.000 x g 5 min için de son tur için aktarılması kullanarak Pelet yıkayın.</li>
	<li>Süpernatant içine atık dikkatle boşaltmak ve Pelet biraz çatlamak başlayana kadar kurumaya Pelet ters bir duman başlıklı ~ 20 dakika veya azot akış altında kağıt mendil izin.</li>
	<li>100-200 µL Pelet büyüklüğüne bağlı olarak protein solubilization arabellek ekleyin. Not: solubilization arabellek mümkün olduğunca düşük örnek eklenen ses tutun. Sonraki filtre destekli örnek hazırlama (FASP) sadece 50 μL örnek sütun başına çözündürüldükten kadar kullanabilirsiniz; herhangi daha birden fazla FASP sütuna bölün olması gerekir.</li>
	<li>Solüsyon içeren temizleyicide ve girdap Pelet çözüm içine. Not örnek viskoz hümik maddelerin bir sonraki Santrifüjü ile kaldırılacak protein birlikte presipite nedeniyle olabilir.</li>
	<li>Örnek protein çözüm solubilize ve protein sindirimi için devam etmek için bir kuluçka makinesi/Shaker 300 rpm, 40 ° C'de 30 dk için salla.</li>
	<li>Ek dondur örnek sıvı azot ve-80 ° C dondurucu store kadar protein sindirimi için hazır.</li>
</ol>2. lipid hazırlık (~ 20 dk zamanlama)
<ol><li>Lipid örnekleri kuru olduğunda, 2:1 kloroform: metanol için şişe, girdap içine çözüm ve transfer 1,5 mL polipropilen boru içine 200 μL ek bir 200 μL cam ekleyin şişe, girdap ve kalan lipidler pipette ve transfer tüp.</li>
	<li>Enkaz 12.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnek dışında santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Süpernatant içine bir cam lipid flakon ve mağaza-20 ° C'de LC-MS/MS Analizi (daha fazla bilgi için Ek yöntemlerLC-MS/MS) kadar transfer.</li>
	<li>Örnekleri hemen hazırlık sonra analiz, lipitler solvent oksidasyon ve yıkımı önlemek için-20 ° C'de depolanması gerekir.</li>
</ol>3. metaboliti hazırlık ve Derivatization (~ 5 h zamanlama)
<ol><li>Çıkarma ertesi günü üzerinde hız Vac metaboliti örnekleri çıkarın ve hazır için derivatization ve GC analizine kadar-20 ° C'de kuru saklayın. Aksi takdirde bir GC metabolitleri çalıştıran sonra araç için uygun iletişim kuralını kullanarak hazırlamak.</li>
	<li>Hemen önce saptırma metabolitleri GC, çözümleme için transfer büyük cam şişeleri metanol, vortexing ve 1,5 mL polipropilen boru ekleme 200 μL ekleyerek. Bir kez yinelenir.</li>
	<li>12.000 x g 10 dk, 4 ° c de tüp santrifüj kapasitesi Süpernatant daha küçük cam şişe aktarmak, top ve tamamen kuru bir hız Vac içinde nefes alabilen bir membran ekleyin.</li>
	<li>Örnek flakon ve 30 için girdap methoxyamine çözüm 20 µL ekleyerek metabolitleri derivatize orta hızda bir vortexer s. Dikkat: Methoxyamine hidroklorid ciddi yanıklar ve gözleri ciddi hasara neden olur, sensitizasyon Ciltle temas tarafından neden olabilir. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş.</li>
	<li>Bir banyo sonicator örnek tamamen çözülmüş emin olmak için kullanın.</li>
	<li>1000 sallayarak d / 1 saat 30 dk için 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.</li>
	<li>Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir. Örnek spin aşağı vasıl 1000 x g 1 dk, RT.</li>
	<li>Silylation (kullanarak) 80 µL n ekleyerek gerçekleştirmek-metil - N-(trimethylsilyl) % 1'i trimethylchlorosilane ile trifluoroacetamide. 10'lar için girdap. Dikkat: MSTFA + %1 TMCS cilt korozyon, ciddi göz hasarı ve belirli hedef organ toksisite neden olabilir ve bir yanıcı sıvı ve buhar. Koruyucu gözlük, eldiven ve önlük giymek ve duman mahallede iş.</li>
	<li>1000 sallayarak d / 30 dk 37 ° C'de tutulan bir yoğunlaşma önleme kapak ile örnek bir kuluçka kuluçkaya.</li>
	<li>Şişeyi kap yüzeyinde yoğun damla ile örnekleri karıştırmak için bir kez ters çevir.</li>
	<li>Spin 2.000 x g, RT, 5 min için aşağı örnek</li>
	<li>Tepki çözüm şişeleri GC-MS analiz için uygun içine aktarın.</li>
</ol>4. protein sindirimi (~ 1 d zamanlama)
<ol><li>15.000 x g 5 min, RT herhangi bir enkaz cips, için de örnek santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>(Bkz. Tablo reçetesi) FASP kullanarak sindirim kitleri için filtre-destekli-örnek-hazırlık (FASP) gerçekleştirmek aşağıdaki değiştirilmiş üreticisinin yönergeleri31,32:<ol>
<li>8 M üre arabelleği 400 μL FASP sütuna (500 μL 30 K MWCO spin filtre) ekleyin.</li>
		<li>Örnek centrifuging sona erdiğinde süpernatant (Pelet silmek) pipet ve en fazla 50 μL örnek 400 μL 8 M üre sütun ekleyin. Not: yalnızca 50 μL örnek sütun başına ekleyin. 50'den fazla μL örnek ise, birden çok sütun kullan ve peptidler sindirim sonra birleştirir. Bu birimin mümkün olduğunca düşük bırakmak en iyisi (30 µL idealdir) FASP sağlamak için sütun tüm kitle spec analizi ile önemli ölçüde etkileyebilir SDS kaldırmak.</li>
		<li>Sütun dahil 1.5 mL tüp içine yerleştirin ve 14.000 x g 30 dk, RT için de örnek santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Akış yoluyla içine atık kaldırmak ve 8 M üre 400 μL sütununu ekleyin ve tekrar santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Önceki adımı 3 üre durular toplam için bir kez daha yineleyin. Not: Eğer varsa örnek gider kuruluk yakın sütun, emin olun daha fazla ~ 30 µL filtre her spin sonra kalan devam centrifuging.</li>
		<li>14.000 x g 20 dk için 50 mM NH4HCO3 ve santrifüj 400 μL ekleyin, atık atmak ve bir kez yinelenir.</li>
		<li>Sütunları bir temiz 1.5 mL santrifüj tüpü aktarın.</li>
		<li>75 μL tripsin sindirim arabelleği için sütunları ekleyin ve 750 rpm bir buğu önleme kapaklı bir kuluçka 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>50 mM NH4HCO3 40 µL için sütunları ekleyin.</li>
		<li>14.000 x g yüksek molekül ağırlıklı kirletici sütun üzerine tutarken tüpün içine peptidler toplamak 15 dakika da örneğine santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>40 μL 50 mM NH4HCO3 sütun ve santrifüj yeniden ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sütun atmak, peptidler hız Vac ~ 30 µL ve BCA tahlil (Bicinchoninic asit protein tahlil kiti; bkz: Malzemeler tablo) tüp içinde aşağı peptidler Makinası.</li>
	<li>SDS kirlenme (görünür kabarcıklar)33şüphesi varsa isteğe bağlı olarak, bir temizlik adımı gerçekleştirin. Katı faz ayıklama daha sonra bu seçeneği belirlemek Eğer yapmanız gerekir. Bu temizlik yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi için Ek yöntemlerkullanılabilir.</li>
	<li>MS analizi için örnek seyreltik veya HPLC ayırma (sonraki iki adımı) isteğe bağlı olarak devam.
</li>
	<li>Fractionate için örnekleri 10 mM amonyum Formiat arabelleği (pH 10.0) ile 400 µL hacmiyle oranında seyreltin.</li>
	<li>Bir C18 sütun çözümlemek ( Tablo malzemelerigörmek) 0.5 mL/dk bir HPLC sistemi kullanarak mobil aşamaları (A) 10 mM amonyum format, pH 10.0 ve (B) 10 mM amonyum format, pH 10.0/Asetonitril (10:90) ayıran tarafından.<ol>
<li>Min 10-70 %65 A % 30 a üzerinden en az 70 ila 85, % 30 A dk 85-95 üzerinden korumak üzerinde degradenin üzerinde ilk 10 dk, %95 A % 95'a e A % %100 65'a ayarlayın.</li>
		<li>Min 95 den 105 üzerinden %100 A ile yeniden equilibrate ve A % 100 dk 120 kadar tutun.</li>
		<li>Kesirler her 1,25 min (96 kesirler üzerinden tüm degrade) toplamak ve nihayet her satır için toplam 12 örnekleri veya her iki satırdan 24 örnekleri için birleştirmek (her biri n = 8 veya n 4 kesirler havuza alınmış =).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vakum altında tüm kesirler kuru ve LC-MS/MS Analizi kadar her depolama-20 ° C'de 15 µL ultrasaf su ekleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hultman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+of+permafrost,+active+layer+and+thermokarst+bog+soil+microbiomes.">Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes.</a> Nature. 521, 208-212 (2015).</li><li>White, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moleculo+long-read+sequencing+facilitates+assembly+and+genomic+binning+from+complex+soil+metagenomes.">Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes.</a> mSystems. 1, (2016).</li><li>White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+of+microbiome+analyses.">The past, present and future of microbiome analyses.</a> Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).</li><li>Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+integrating+data+to+uncover+genotype-phenotype+interactions.">Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions.</a> Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).</li><li>Jansson, J. K., Baker, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-omic+future+for+microbiome+studies.">A multi-omic future for microbiome studies.</a> Nat Microbiol. 1, (2016).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+considerations+when+selecting+a+quantitative+proteomics+strategy.">Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy.</a> Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).</li><li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+proteomics.">Targeted proteomics.</a> Nat Methods. 10, 19-22 (2013).</li><li>Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics.">Targeted metabolomics.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2012).</li><li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues.">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).</li><li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPLEx:+a+Robust+and+Universal+Protocol+for+Single-Sample+Integrative+Proteomic,+Metabolomic,+and+Lipidomic+Analyses.">MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses.</a> mSystems. 1, (2016).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+analysis+reveals+regulators+of+the+response+to+nitrogen+limitation+in+Yarrowia+lipolytica.">Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica.</a> BMC Genomics. 17, 138 (2016).</li><li>Tisoncik-Go, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Omics+Analysis+of+Pathogenic+Host+Responses+during+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+Infection:+The+Crucial+Role+of+Lipid+Metabolism.">Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism.</a> Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).</li><li>Kyle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+biologically+significant+lipid+isomers+with+liquid+chromatography,+ion+mobility+spectrometry+and+mass+spectrometry.">Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry.</a> Analyst. 141, 1649-1659 (2016).</li><li>Lovelace, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silymarin+Suppresses+Cellular+inflammation+by+inducing+reparative+stress+signaling.">Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling.</a> J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diel+metabolomics+analysis+of+a+hot+spring+chlorophototrophic+microbial+mat+leads+to+new+hypotheses+of+community+member+metabolisms.">Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms.</a> Front Microbiol. 6, 209 (2015).</li><li>Pomraning, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Metabolomic,+Lipidomic+and+microscopic+profiling+of+Yarrowia+lipolytica+during+lipid+accumulation+identifies+targets+for+increased+lipogenesis.">Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis.</a> PLoS One. 10, e0123188 (2015).</li><li>Huang, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fungus+gardens+of+leaf-cutter+ants+undergo+a+distinct+physiological+transition+during+biomass+degradation.">The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).</li><li>Deatherage Kaiser, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multi-Omic+View+of+Host-Pathogen-Commensal+Interplay+in+Salmonella-Mediated+Intestinal+Infection.">A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection.</a> PLoS One. 8, e67155 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+modulates+metabolism+during+growth+under+conditions+that+induce+expression+of+virulence+genes.">Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes.</a> Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-omic+systems+approach+to+elucidating+Yersinia+virulence+mechanisms.">A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms.</a> Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).</li><li>Bordbar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-driven+multi-omic+data+analysis+elucidates+metabolic+immunomodulators+of+macrophage+activation.">Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation.</a> Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).</li><li>Hu, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+response+of+human+skin+tissue+to+low+dose+ionizing+radiation.">Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation.</a> Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).</li><li>Perera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+virus+infection+perturbs+lipid+homeostasis+in+infected+mosquito+cells.">Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells.</a> PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversed-phase+capillary+ultra-performance+liquid+chromatography-mass+spectrometry+(UPLC-MS)+method+for+comprehensive+top-down/bottom-up+lipid+profiling.">A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling.</a> Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).</li><li>Sorensen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbations+in+the+lipid+profile+of+individuals+with+newly+diagnosed+type+1+diabetes+mellitus:+Lipidomics+analysis+of+a+Diabetes+Antibody+Standardization+Program+sample+subset.">Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset.</a> Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).</li><li>Diamond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+proteome+and+lipidome+profiles+reveal+hepatitis+C+virus-associated+reprogramming+of+hepatocellular+metabolism+and+bioenergetics.">Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics.</a> PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).</li><li>Alquier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+GPR40+impairs+glucose-induced+insulin+secretion+in+vivo+in+mice+without+affecting+intracellular+fuel+metabolism+in+islets.">Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets.</a> Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+accurate+mass+and+time+tag+approach+in+studies+of+the+human+blood+lipidome.">Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).</li><li>Rasmussen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+virology+identifies+a+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+enzyme,+dodecenoyl+coenzyme+A+delta+isomerase,+required+for+hepatitis+C+virus+replication+and+likely+pathogenesis.">Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis.</a> J Virol. 85, 11646-11654 (2011).</li><li>Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+and+digestion+for+proteomic+analyses+using+spin+filters.">Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters.</a> Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Zhou, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+sodium+dodecyl+sulfate-assisted+sample+preparation+method+for+LC-MS-based+proteomics+applications.">Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications.</a> Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+abundance+of+type+III+secretion+system-inducing+signals+in+Arabidopsis+mkp1+enhances+resistance+against+Pseudomonas+syringae.">Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).</li><li>Chourey, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+lysis/protein+extraction+protocol+for+soil+metaproteomics.">Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics.</a> J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).</li><li>Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+probabilities+and+generating+functions+of+tandem+mass+spectra:+a+strike+against+decoy+databases.">Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases.</a> J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).</li><li>Kim, S., Pevzner, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS-GF++makes+progress+towards+a+universal+database+search+tool+for+proteomics.">MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics.</a> Nat Commun. 5, 5277 (2014).</li><li>Cole, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototrophic+biofilm+assembly+in+microbial-mat-derived+unicyanobacterial+consortia:+Model+systems+for+the+study+of+autotroph-heterotroph+interactions.">Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions.</a> Front Microbiol. 5, (2014).</li><li>Isaacson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+extraction+techniques+for+enhanced+proteomic+analysis+of+plant+tissues.">Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues.</a> Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Belirli yöntemleri, örneğin lizis adım, adapte edilebilir böylece tüm laboratuvarlar aynı kullanılabilir donanım olduğunu unutmamak gerekir. Burada kullanıyoruz vortexing ve sonicating, ancak bir büyük 50 mL boncuk çırpıcı kullanımı işe yarar. Bir toplayıcı sıcaklığı-105 ° C yetenekli bir lyophilizer yoksa, o zaman örnekleri bir azot akış altında kurutulmuş. Ayrıca toprak türleri çok çeşitli ve kum, silt, kil, torf ve kerpiç (vb) içerebilir ve onlar da pH, tuzluluk ve organ...

Toprak mikrobiyal toplulukları değerlendirirken karbon Bisiklete binme ve iklim değişikliği anlamak için önemli sonuçları vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda ancak microbiota çeşitli toprak tipleri için sıralı genleri eksikliği ve birçok tespit proteinlerin bilinmeyen fonksiyon gibi zorluklar sermiştir. Bu zorluklar sonucu1,2,3bugüne kadar bilinen en karmaşık mikrobiyal topluluk olmak toprak nedeniyle. Birleştirme sonuçları metagenomic, metatranscriptomic, metaproteomic, metabolomic ve lipidomic çalışmaları, Multi-omic analizleri, son zamanlarda içine mikropların mevcut ise daha büyük bir anlayış kazanmak için çok sayıda toprak çalışmalarda hayata geçirdik çevre tedirginlikler1,4,5nedeniyle gerçekleşen moleküler değişiklikler hakkında kapsamlı bilgi edinme. Multi-omic çalışmaları ile bir meydan okuma kütle spektrometresi (MS) olduğunu-tabanlı metaproteomic, metabolomic ve lipidomic ölçümleri genellikle MS uyumlu6,7 olmak her omic için bir özel ayıklama işlemi gerektirir , 8 , 9. sınırlı bir miktar örneği yalnızca kesin bu yordamları bunların uygulanması çok güç veya imkansız ne zaman yapmak. Bu sorunlar bize bir eşzamanlı metaboliti, protein ve lipit ayıklama (karmaşık) yöntemi daha küçük örnek birimleri veya kitleler kullanarak, doğruluğu artırma ve daha hızlı örnek hazırlıklar tüm üç analizleri için sağlama yeteneğine sahip araştırmak için isteniyor 10. bugüne kadar tüm bu gol elde edebilirsiniz hiçbir alternatif toprak ayıklama yordamlar vardır.
Küresel multi-omic analizleri tek toprak örneği etkinleştirmek için kloroform, metanol ve su ayrımları dayalı bir organik solvent ekstraksiyon protokolü kullanıldığında10yaşındaydım. Bu yöntem was orijinal gelişmiş toplam lipid çekimi9,11 ve son zamanlarda bir tek örnek12,13 metabolitleri, proteinler ve yağlar ekstraksiyon eşzamanlı değiştirilmiştir ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, daha az örnek miktar etkinleştirme 23,24,25,26,27,28,29,30, ve Deneysel değişkenlik10. Karmaşık iletişim kuralında kloroform örnek bileşenlerinin trifazik kimyasal ayırma içine ayrı kesirler için temel sağlar su ile karışan değil. En iyi sulu faz bu nedenle alt kloroform aşamasında (Şekil 1) ardından bir protein disk ve sonra bir lipit katmanı hidrofilik metabolitleri içerir. Karmaşık çoğu topraklar için uygulandığında, partikül enkaz örnekleme tüpler çok altında birikir ve tüm katmanları toplandıktan sonra iptal edilecek. Her toprak tipi-ebilmek var olmak farklı, ancak ve torf gibi son derece organik toprak, toprak enkaz Orta katmanda kalır ve örnekleme tüp altına girmemektedir. Karmaşık sağlar çeşitli yararları 1) küçük örnek miktarlarda multi-omic analizleri, aynı örnek azalma gelen 2) multi-omic çekimi için kullanılan gibi birden fazla molekül yalıtma aynı örnekten yazdığında genel olarak deneysel değişkenliği, ve 3) daha fazla sayıda örnekleri çok daha hızlı daha yüksek üretilen iş çalışmalar10için hazır olun. Birlikte bu faydalar toprak örnekleri ve karmaşık mikrobiyal topluluklar değerlendirmek için daha iyi ölçüm yeteneği sağlamak için hayati önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Purified water from Millipore</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>Water purification system.</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6026</td><td>!Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses.</td></tr><tr><td>Soil protein extraction kit</td><td>MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen</td><td>30000-20</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>1M Trizma HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2694</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td>!Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Stored at -20&amp;deg;C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td>!Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses</td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V528A</td><td>20&amp;micro;g vials</td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Formate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09735</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td>!Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>!Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904</td><td>!Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>!Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69478</td><td>!Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood.</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water purification system</td><td>Millipore</td><td></td><td>model MPGP04001</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>Probe sonicator</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>model FB505</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>model 5810R</td></tr><tr><td>50mL tube swinging bucket rotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td>50mL fixed angle rotor</td><td>Eppendorf</td><td>FA-45-6-30</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>OHAUS</td><td></td><td>model V22PWE150IT</td></tr><tr><td>Serological pipette controller</td><td>Eppendorf</td><td>12-654-100</td><td></td></tr><tr><td>10mL, 25mL glass serological pipettes</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-27F, 13-678-36D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer with Thermotop</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015, 5308000003</td><td></td></tr><tr><td>0.9 &amp;ndash; 2.0 mm blend stainless steel beads</td><td>NextAdvance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>0.15 mm garnet beads</td><td>MoBio</td><td>13122-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>FisherBrand</td><td>11-100-16SH</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir bar</td><td>FisherBrand</td><td>14512130</td><td></td></tr><tr><td>pH paper strips, pH range 0&amp;ndash;14</td><td>FisherBrand</td><td>M95903</td><td></td></tr><tr><td>15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103 21-108</td><td>chloroform compatible</td></tr><tr><td>50mL vortex attachment</td><td>MoBio</td><td>13000-V1-50</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>FisherBrand</td><td>02-591-44</td><td></td></tr><tr><td>27.25x70mm glass vials</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Breathe Easier plate membranes</td><td>Midwest Scientific</td><td>BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Diversified Biotech</td><td>BPWP-1000</td><td></td></tr><tr><td>Heater shaker incubator</td><td>Benchmark, Incu-Shaker Mini</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analog rotisserie tube rotator</td><td>SoCal BioMed, LLC</td><td>82422001</td><td></td></tr><tr><td>Filter-Aided-Sample-Prep kit</td><td>FASP; Expedeon</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Biotek, EPOCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20 Degree Celsius Freezer</td><td>Fisher</td><td>13986149</td><td></td></tr><tr><td>-80 Degree Celsius Freezer</td><td>Stirling Ultracold</td><td>SU78OUE</td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive ion trap mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters NanoEquityTM UPLC system</td><td>Millford, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250mL media bottle</td><td>FisherBrand</td><td>1395-250</td><td></td></tr><tr><td>Waters vial</td><td>Waters</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>Glass MS sample vial and inserts</td><td>MicroSolv</td><td>9502S-WCV, 9502S-02ND</td><td></td></tr><tr><td>Glass HPLC vial and snap caps</td><td>MicroSolv</td><td>9512C-0DCV, 9502C-10C-B</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 96-well plate</td><td>Agilent</td><td>5042-6454</td><td></td></tr><tr><td>Large glass vial 27.25x70mm</td><td>FisherBrand</td><td>03-339-22K</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td>7934021</td><td></td></tr><tr><td>Polished stainless steel flat head spatula</td><td>Spoonula; FisherBrand</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34721</td><td></td></tr><tr><td>XBridge C18, 250x4.6 mm, 5 &amp;mu;M with 4.6x20 mm guard column</td><td>Waters</td><td>186003117, 186003064</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 series HPLC system</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1380-90000</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL centrifuge tube</td><td>Sorenson</td><td>11700</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50&amp;micro;L and 250&amp;micro;L</td><td>Hamilton</td><td>81517, 80975, 81175</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette Bulbs</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z111597</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson 1800 Ultrasonic Cleaner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Centrifuge</td><td>Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin Columns, C18 Silica</td><td>The Nest Group</td><td>SEM SS18V</td><td></td></tr></tbody></table>

the mplex protocol for multi-omic analyses of soil samples

Kütle spektrometresi (MS)-tabanlı entegre metaproteomic, metabolomic ve lipidomic (multi-omic) çalışmaları bizim yetenek anlamak ve mikrobiyal topluluklar çevre ve biyolojik sistemleri karakterize dönüştürme. Bu ölçümler bile en karmaşık toprak mikrobiyal topluluklar, gelişmiş analizler etkinleştiriyorsanız bugüne kadar bilinen karmaşık mikrobiyal sistemleri. Ayrı çekimi genellikle gerekli örnek miktarı ve hazırlık zamanı böylece önemli ölçüde yükseltecek her omic çalışması için gerekli olan bu yana Multi-omic analizleri, ancak, örnek hazırlama zorluklar vardır. Bu sınırlama adrese, 3'ü 1 metodu metabolitleri, proteinler ve yağlar (karmaşık) eşzamanlı çekme--dan aynı toprak örneği için solvent bazli bir yaklaşım adapte tarafından oluşturulur. Bu karmaşık iletişim kuralı ne zaman bile sınırlı miktarlarda karmaşık toprak örnekleri için kullanılan basit ve pek çok örnek türü, sağlam olduğu ispatlanmıştır. Karmaşık yöntem da büyük ölçüde daha iyi bir mikrobiyal her topluluk üyeleri biyolojik ve çevresel tedirginlikler üzerine gerçekleşen değişiklikleri değerlendirme sırasında anlayış kazanmak için gerekli hızlı multi-omic ölçümleri etkin.

Molekülleri Kansas yerel kır topraktan (Mollisol toprak) ayıklamak için karmaşık iletişim kuralı kullanıldığında, ineklemek analizleri sonuçları 3376 peptidler, 105 lipidler ve 102 kutup metabolitleri (tüm benzersiz kimlikleri) için sağlanan. Süre karmaşık iletişim kuralı lipidler ve metabolitleri12,13,14,15,16<...

Watch this Scientific Journal Video about The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples at JoVE.com

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.

Toprak örnekleri Multi-omic analizleri için karmaşık iletişim kuralı

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

the-mplex-protocol-for-multi-omic-analyses-of-soil-samples

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.9K Görüntüleme.  Pacific Northwest National Laboratory. Bir iletişim kuralı aynı anda metabolitleri, proteinler ve yağlar bir tek toprak örneğinden ayıklanması, azaltılmış örnek hazırlama kez izin ve multi-omic kütle spektrometresi analizleri ile sınırlı miktarda örnekleri etkinleştirme için sunulmaktadır.

Video: The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Genetik

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Nanopore DNA sıralama Metagenomic toprak analizleri için

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

Çevre

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

Karmaşık doğal organik madde karışımları karakterize için tek işlem hacmi tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü analitik teknikler

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Gelişim Biyolojisi

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect and quantify hundreds of thousands of metabolite features. However, the application of these techniques to a large number of samples is subject to more complex interactions, particularly for genome-wide association studies (GWAS). This protocol describes an optimized metabolic workflow, which combines an efficient and fast sample preparation with the analysis of a large number of samples for legume crop species. This slightly modified extraction method was initially developed for the analysis of plant and animal tissues and is based on extraction in methyl tert-butyl ether: methanol solvent to allow the capture of polar and lipid metabolites. In addition, we provide a step-by-step guide for reducing analytical variations, which are essential for the high-throughput evaluation of metabolic variance in GWAS.

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies Mo-GWAS: Guidelines for Sample Preparation and Normalization

In this protocol, we present an optimized workflow, which combines an efficient and fast sample preparation of many samples. In addition, we provide a step-by-step guide to reduce analytical variations for high-throughput evaluation of metabolic GWAS studies.

Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Biyokimya

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during development and in disease states. Single-cell RNA sequencing allows us to comprehensively profile gene expression changes observed in retinal development and disease at a cellular level, while single-cell ATAC-Seq allows analysis of chromatin accessibility and transcription factor binding to be profiled at similar resolution. Here the use of these techniques in the developing retina is described, and MULTI-Seq is demonstrated, where individual samples are labeled with a modified oligonucleotide-lipid complex, enabling researchers to both increase the scope of individual experiments and substantially reduce costs.

Here, the authors showcase the utility of MULTI-seq for phenotyping and subsequent paired scRNA-seq and scATAC-seq in characterizing the transcriptomic and chromatin accessibility profiles in retina.

scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Nörobilim

High-throughput and Deep-proteome Profiling by 16-plex Tandem Mass Tag Labeling Coupled with Two-dimensional Chromatography and Mass Spectrometry

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an expanded 16-plex TMT method has been introduced, which further increases the throughput of proteomic studies. In this manuscript, we present an optimized protocol for 16-plex TMT-based deep-proteome profiling, including protein sample preparation, enzymatic digestion, TMT labeling reaction, two-dimensional reverse-phase liquid chromatography (LC/LC) fractionation, tandem mass spectrometry (MS/MS), and computational data processing. The crucial quality control steps and improvements in the process specific for the 16-plex TMT analysis are highlighted. This multiplexed process offers a powerful tool for profiling a variety of complex samples such as cells, tissues, and clinical specimens. More than 10,000 proteins and posttranslational modifications such as phosphorylation, methylation, acetylation, and ubiquitination in highly complex biological samples from up to 16 different samples can be quantified in a single experiment, providing a potent tool for basic and clinical research.

Presented here is an optimized high-throughput protocol developed with 16-plex tandem mass tag reagents, enabling quantitative proteome profiling of biological samples. Extensive basic pH fractionation and high-resolution LC-MS/MS mitigate ratio compression and provide deep proteome coverage.

Isobaric tandem mass tag (TMT) labeling is widely used in proteomics because of its high multiplexing capacity and deep proteome coverage. Recently, an ...