Name: tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons
Uploaded: 2018-03-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons at JoVE.com

この作品は、ネバダ大学リノ校からスタートアップ資金、国立衛生研究所許可番号 P20 GM103650 の下の日の出にサポートされていました。

1. 動作アリーナの構築と行動の分野で光刺激を有効にするハードウェアの準備
<ol><li>光の射さない動作アリーナを構築する 66 cm3 x 61 x 89 のディメンションを持つボックスを構築 (35"L x 24" W x 26"H) 製の黒着色されたプレキシ ガラス アクリル シート (厚さ 3 mm) (材料の表を参照してください)。このようなボックスを構築する材料はローカルのハードウェア店で利用できるべきであります。動作室 (図 1A) でテーブルの上には、このボックスを配置します。</li>
	<li>白黒 USB 3.0 CCD カメラが装備 IR ロングパス 830 nm フィルターと 8 mm F1.4 C マウント レンズ マウント (材料表参照) ブラック ボックスの天井の中心に。場所 2 つの赤外線 LED ストリップ (材料表参照) テーブルの上に暗いアリーナ (図 1A) で幼虫を照らすために。</li>
	<li>LED プラットフォームを構築するには、22 cm × 22 cm の正方形アルミ板 (できれば任意の反射を除去するためにマット ブラック仕上げと塗装スプレー) を取得します。金属のカッターを使用して、プレートの中心部に CCD カメラの周りに合うように十分な大きさの穴をカットします。</li>
	<li>赤 LED ストリップ ライト (材料の表を参照) と金属板をカバーしてください。シリーズの LED 光ストリップ線をはんだ付けし、ラズベリーパイ 2B マイクロプロセッサによって制御フォトカプラー リレーにストリップ線をフィード (材料の表を参照してください) (図 1Bと2)。</li>
	<li>インストールし、ラズベリーパイ プロセッサ上フォトカプラー リレーを LED ストリップに接続する前に Ubuntu の仲間/Raspian ジェシー/Linux ベース オペレーティング システムを構成します。電源を電源 LED ストリップとフォトカプラー (図 2) を添付 (材料の表を参照してください)。CCD カメラ (図 1B) の周り LED プラットフォームをマウントします。 注: Ubuntu メイト v16.04 オペレーティング システムは自由に利用できます。Python ベースの簡単なコマンドのセットは、LED 光刺激 (構文のファイルを参照してください) のプログラム パターンに容易に適応することができます。</li>
	<li>行動の分野での様々 なポイントで均一な照度を確保します。分光計の助けを借りて、アリーナの表面で絶対放射照度を測定し、アリーナの表面全体で ~1.3 W/m2であることを決定します。 注: この強度で大幅な変更は認められなかった温度の実験の経過。10の別の研究は、~1.9 W/m2の高い照度を使用し、実験の過程で温度の変化は認められなかった。</li>
</ol>2.ショウジョウバエ幼虫の挙動解析のための準備
<ol><li>標準的なはえの食糧にハエを維持 (材料表参照) 25 ° C、相対湿度 50-60% と 12/12 h 明暗サイクルで。</li>
	<li>
CsChrimson ORNs の一組を表現するために処女の女性をUA IV CsChrimsonラインからポインタ Gal4ラインから男性にクロス (21 幼虫匂い受容体の 1 つに対応する 'X' (または) 各一意に表現される遺伝子21 対 ORNs)9,11。
	<ol>
<li>代わりに、すべて 21 幼虫 ORNs でCsChrimsonを表現するためにUAS IV CsChrimsonから処女女性クロス行男性 ('同居者' はすべて 21 ORNs で表される共受容体)及び同居 Gal4ラインから。</li>
		<li>これらの実験のコントロールとしてひとりでにUAS IV CsChrimson線を使用します。 注: ここに記載されているはえの在庫全てがブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クロスで男性と女性のハエはチームメイトし、48 時間卵を産むを許可した後は、新鮮なバイアルに大人を転送します。
	<ol>
<li>卵を含む食品のバイアルの表面、ジメチルスルホキシド (DMSO) で溶解した 400 μ M すべて trans 網膜 (ATR) と蒸留水に溶解した 89 mM ショ糖を含んでいる混合物の 400 μ L を追加します。 注: ショ糖の少量は、ATR ソリューションの幼生供給を推進しています。ATR は CsChrimson 式9,10の骨折に必要な補酵素です。ATR は光に敏感です。</li>
		<li>卵を含む食品のバイアルに ATR を追加すると、さらに 72 時間暗闇の中でバイアルを孵化させなさい。 メモ: ATR 挿入による幼虫の挙動に及ぼす影響は、この研究と上記の 2 つの研究は観察していなかった間、ATR は ATR が含まれていない上記の混合物の同じ量をテスト線をかけることによって給餌の影響を制御することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>はえの食糧の表面から 3 齢幼虫 (産卵後 ~ 120 h) を抽出するには、高密度 (15%) ショ糖液を使用してそれらをフローティングします。マイクロ ピペットは 1000 mL のガラス製ビーカーにショ糖液の表面に浮かんで幼虫を別、P1000 を使用します。</li>
	<li>ガラス ビーカーに 800 mL の新鮮な蒸留水たびに交換することによって幼虫の 3-4 回を洗ってください。動作分析へそれらを服従させる前に 10 分間休息する幼虫を許可します。</li>
</ol>3. 動作分析
<ol><li>(22-25 ° C) の間の一貫性のある温度を維持動作ルーム (50 と 60 %rh) 湿度。</li>
	<li>
22 cm × 22 cm の正方形のペトリ皿に溶かしたアガロース (1.5%) の 150 mL の注入によって幼虫クロール メディアを準備します。1 つのペトリ皿アッセイ実験あたり 8-10 試験の各試験に注がれています。アガロースを固めるし、ペトリ皿で 1-2 時間動作の分析でそれらを使用する前に冷却を許可します。
	<ol>
<li>準備中の 3 齢幼虫の 20 以上のシャーレ (図 1C) のセンターに移転します。そのふた付きシャーレをカバーします。CCD カメラの下で動作アリーナにペトリ皿を配置します。 注: 実験によって動作の試金は通常実施 3-5 分。指導の手がかりを提供するアッセイで、臭気物質を使用する場合は、生成される臭気グラデーションまま約 5 分の1の安定を観察されています。長時間の試金は推奨されません。これらの時間のポイント内で幼虫脱水のためまたは長期 630 nm の赤色光の暴露からの有害な効果はみられていません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電源 ON、850 nm 赤外 LED 光源のビデオで幼虫を視覚化します。幼虫の動きを記録する CCD カメラを起動します。</li>
	<li>ラズベリーパイ プロセッサ、プログラム赤色光刺激の適切なパターンを管理するための手順に関連付けられているソフトウェアを使用しています。 注意: Python ベースの簡単なコマンドのセットは LED 光刺激 (構文のファイルを参照してください) のプログラム パターンに容易に適応することができます。</li>
</ol>4. データ処理と解析
<ol><li>Matlab のような任意の利用可能なプログラミング ソフトウェアに各試行の記録ビデオをインポートします。</li>
	<li>時間の関数としての映画ですべての幼虫の XY 座標を取得します。追跡ソフトウェアの制限に基づいて、15-20 の 3 齢幼虫は 1 つのムービー1,8で追跡できます。 注: 適切な条件 (構文のファイルを参照してください) に合わせて簡単に適応することができます単純な Matlab コード ('Tracklarva') のセットが提供されます。このプログラムは実験ですべての試験を組み合わせた、アッセイの全体の持続期間のためのすべての幼虫の XY 座標を出力 (次のコードの構文を参照してください)。代わりに、1 つは、研究者の自由に利用できるいくつかのオープン ソースのベースのプログラムを使用できます。例えばJAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12。</li>
	<li>
幼虫の軌道をプロットして幼虫の歩行の分析には、XY 座標が生成を使用します。
	<ol>
<li>動作解析、シーケンス実行のターンを交互に個々 の幼虫軌跡をセグメントし、スピード、パスの曲率、針路などナビゲーション統計を使用します。</li>
		<li>実行は、前方への動きの連続的な期間として定義されます。ターンでは、連続した実行を分離します。ターンは、軌道の向き角度に変更があったときにフラグが設定された > 45 ° (構文のファイルを参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>必要に応じて長さ、実行の方向、およびその他のパラメーターを実行、実行速度の平均値を計算します。 注意: 幼虫の軌跡から '実行' と '停止' を抽出するための簡単な構文のセットは付属 (構文のファイルを参照してください)。単純な Matlab または Excel ベース関数を '長さの実行' '実行速度' の値を計算するための抽出されたデータに適用できる等。</li>
	<li>± SEM. を意味それぞれの行動指標のデータを表す</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

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ここでは、ショウジョウバエ幼虫嗅覚ニューロンの同時光活性化への応答挙動の測定では、方法について説明しました。前に説明したトラッキング方法1,幼虫8 ORNs をアクティブに異なる臭気配信技術を使用します。ただし、これらのメソッドは、特異性または ORN 活性化の時空間パターンのいずれかを制御できません。本手法は、ORN 活性化?...

ショウジョウバエ幼虫の環境で嗅覚情報を最終的に決定する幼虫の行動1,2,3,4のみ 21 機能的に異なる ORNs、活動によって検知されます。まだ、比較的少しはこれらの 21 ORNs の活動、感覚情報がエンコードされたロジックについていいます。こうして、実験的行動に各幼虫 ORN の機能の貢献を測定する必要があります。
ショウジョウバエ幼虫 ORNs の全体のレパートリーの感覚応答プロファイル詳細1,4、5、個々 ORNs 嗅覚回路を図りするの貢献研究されていますがナビゲーションの動作は不明します。幼虫の行動研究の難しさはこれまでのところ、時空間単一 ORNs をアクティブにすることができないのために発生します。21ショウジョウバエ幼虫 ORNs の 19 を明示的にアクティブに匂いのパネルは、最近は、1だった。低濃度で、パネルの各臭気物質は、その同種 ORN からのみ生理反応を引き出します。しかし、従来の動作の試金で使用される通常より高い濃度で各臭気物質は複数 ORNs1,5,6からの生理学的な応答を引き出します。さらに、このパネルで匂いは安定した臭気グラデーション7,8の形成に依存する行動の研究の解釈を複雑にする情勢に変わった。最後に、当然のことながら発生するニオイ刺激に対する実験室の条件の下で複製することは困難であるテンポラル コンポーネントが存在します。したがって、空間的で、一時的な方法で個々 の ORNs を同時にアクティブ化中の幼虫の行動を測定できる手法を開発する重要です。
ここでは、前述の幼虫のトラッキングの利点を持つメソッド1,8の試金を示しています。Gershowらに記載されている追跡アッセイは、動作アリーナ8内の臭気の安定勾配を維持するために電子制御バルブを使用します。ただし、臭気刺激セットアップを構築に関与する複雑なエンジニア リング レベルのため、このメソッドは他の所で複製することは困難です。さらに、単一 ORNs を明示的にアクティブにする匂いを使用に関連する問題が未解決のまま。マシューらに記載されている追跡分析簡単匂いの配信システムを使用しますが、生成される臭気グラデーションはテスト臭気物質の揮発性に依存してアッセイ1の長期間にわたって安定ではないです。したがって、臭気刺激を光刺激に置き換えることによって提案手法は制御 ORN 活性化の特異性の利点があり、異なる強度の臭気勾配の形成には依存しません。
私たちのメソッドは、簡単にセットアップショウジョウバエ幼虫ナビゲーションの側面を測定する際に興味を持って研究に適した。この手法は、研究者が選択の彼らのお気に入りのシステムの neuron(s) におけるCsChrimsonの発現をドライブすることができる他のモデル システムに合わせることができます。CsChrimsonは、チャネルのロドプシンの赤いシフト バージョンです。幼虫の走光性システムには見えない波長でアクティブには。したがって、特異性、信頼性、および再現性9ニューロンの活動を操作することがられます。カスタム主題のサイズの変更を考慮してソフトウェアを書かれたを変更すると、このメソッド簡単に他の昆虫の幼虫をクロールに適応できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Video camera to capture larval movement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>106215</td><td></td></tr><tr><td>M52 to M55 Filter Thread Adapter</td><td>Edmund Optics</td><td>59-446</td><td></td></tr><tr><td>2&quot; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>59-445</td><td></td></tr><tr><td>RG-715, 2&quot; Sq. Longpass Filter</td><td>Edmund Optics</td><td>46-066</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electronics for optogenetic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raspberry Pi 2B</td><td>RASPBERRY-PI.org</td><td>RPI2-MODB-V1.2</td><td></td></tr><tr><td>3 Channel programmable power supply</td><td>newegg.com</td><td>9SIA3C62037092</td><td></td></tr><tr><td>8 Channel optocoupler relay</td><td>amazon.com</td><td>6454319</td><td></td></tr><tr><td>630nm Quad-row LED strip lights</td><td>environmentallights.com</td><td>red3528-450-reel</td><td></td></tr><tr><td>850nm LED strips</td><td>environmentallights.com</td><td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu MATE v16.04</td><td>Nubuntu</td><td>https://github.com/yslo/nubuntu</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plexiglass black acrylic</td><td>Home Depot</td><td>MC1184848bl</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly food and other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrifly fly food</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-112</td><td></td></tr><tr><td>Agarose powder</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>22cm X 22cm square petri-dish</td><td>VWR Inc.</td><td>25382-327</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>All trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-IVS-CsChrimson&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55134</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Orco-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or42a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9970</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Or7a-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>23907</td><td></td></tr></tbody></table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

臭気源に向かって移動する昆虫の機能は (ORNs) 一次嗅覚受容ニューロンの活動に基づいています。ORN 匂いレスポンスに関する大量の情報が生成されている特定 ORNs 行動反応を推進する上での役割のままかりです。挙動解析における合併症を生じ個々 ORNs、単一の匂いと嗅覚刺激による自然観察された変化を複製の難しさによって活性化される複数 ORNs をアクティブな匂い分子の別のボラティリティ研究室では、従来の臭気配信方法。ここでは、その ORNs の同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を分析するプロトコルについて述べる。ここで使用される光技術 ORN 活性化の特異性や ORN 活性化の時空間パターンの正確な制御ができます。対応する幼虫の動きは追跡され、デジタル記録、カスタム ソフトウェア書かれたを使用して分析します。光刺激と匂い刺激に置き換えて、このメソッドは、幼虫の行動への影響を研究するために個々 の ORN の活性化のより正確な制御できます。幼虫に及ぼす局所介在ニューロン (LNs) だけでなく、二次投射ニューロン (PNs) の影響を研究する手法をさらに拡張できます。このメソッドはこのように嗅覚回路関数の包括的な郭清を有効にして動作応答でどのように嗅覚ニューロン活動を補完する研究に翻訳します。

ORN 活性化の特異性を示すためには、正常に用いる 2 つの異なる ORN (ORN::7a ・ ORN::42a) の影響を判断する (Or7a または Or42a のいずれかを表現する ORNs) 活性化幼虫動作 (図 3)。個々 最近の研究と一致して幼虫 ORNs は機能的に異なる1,10,13、当社の代表的なデータを示します CsChrimson ...

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嗅覚ニューロンの光遺伝学的刺激に応答したショウジョウバエ幼虫の行動の追跡 |神経科学 |ビデオ

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々 の嗅覚ニューロンをアクティブに使用されます。幼虫の動きが同時に追跡、デジタル記録、カスタムで作成されたソフトウェアを使用して分析します。

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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7.2K ビュー.  University of Nevada. このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々 の嗅覚ニューロンをアクティブに使用されます。幼虫の動きが同時に追跡、デジタル記録、カスタムで作成されたソフトウェアを使用して分析しま?...

ビデオ: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

生物学

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

神経科学

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study introduces easy-to-implement setups for applying optogenetic methods in Drosophila melanogaster. Two optogenetic tools, CsChrimson, a red-light-activated cation channel, and GtACR2, a blue-light-activated anion channel, were employed in four experimental approaches. Three of these approaches involve single-fly experiments: (1) a blue-light optogenetic thermotactic positional preference assay targeting temperature-sensitive heating cells, (2) a red-light optogenetic positional preference assay activating bitter sensing neurons, and (3) a proboscis extension response assay activating the sweet-sensing neurons. The fourth approach (4) is a fly maze setup to assess avoidance behaviors using multiple flies. The ability to manipulate neural activity temporally and spatially offers powerful insights into sensory processing and decision-making, underscoring the potential of optogenetics to advance our knowledge of neural function. These methods provide an accessible and robust framework for future research in neuroscience to enhance the understanding of specific neural pathways and their behavioral outcomes.

This paper presents methods for optogenetic manipulation in Drosophila melanogaster, utilizing CsChrimson and GtACR2 to activate and silence specific neurons. Four experiments are described to utilize optogenetics to explore thermotactic and gustatory behaviors, providing insights into the underlying neural mechanisms governing these processes.

Drosophila melanogasterにおける神経回路の光遺伝学的操作のための行動アッセイ

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

Navigational Behavior of Drosophila Larvae in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Sensory Neurons

Source: Clark, D. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57353">Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a study of the navigational behavior of Drosophila larvae in response to optogenetic stimulation of olfactory sensory neurons (ORNs). Transgenic Drosophila larvae expressing light-sensitive ion channels in the ORNs are placed on agarose within a behavior arena. Optogenetic stimulation with light opens the channels, causing a cation influx that triggers the transmission of the signal to the brain, and the navigation behavior is recorded.

嗅覚ニューロンの光遺伝学的刺激に対するショウジョウバエ幼虫のナビゲーション行動

1. Building a Behavior Arena and Preparing Hardware to Enable Optogenetic Stimulation in the Behavior Arena

	To build a light-deprived behavior arena, ...

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

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ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

で食欲連想嗅覚学習

で逃避行動のOptogenetic刺激

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動

臭気誘導挙動の高分解能定量

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Drosophila melanogasterにおける神経回路の光遺伝学的操作のための行動アッセイ

嗅覚ニューロンの光遺伝学的刺激に対するショウジョウバエ幼虫のナビゲーション行動