我々は、特に彼らの実験設定と原稿のコメントに関する技術的な手順については、ガーバー·ラボのメンバーに感謝したいと思います。我々はまた、野生型カントン株式のフライケアとメンテナンスのためリュボフPankevychに感謝します。この作品は、DFG助成TH1584/1-1、SNFの助成31003A_132812 / 1およびコンスタンツ大学のZukunftskolleg（全ASTに）によってサポートされています。

1。準備<ol><li> ショウジョウバエの野生型幼虫は10分の14明/暗サイクルにおける℃、60％〜80％相対湿度は25で提起されています。幼虫の正確な年齢を制御するために、常に20人の女性は、標準的なフライ食品の約6mlを含む1バイアル（6cmの高さと直径2.5cm）に10人の男性に置かれます。ハエは12時間の卵を産むために許容されていて、二日目には新しいバイアルに移しています。 25℃で飼育し、現在行動実験のために使用することができれば産卵後5-6日幼虫は摂食第3齢期に達する。しかし、人はバイアルの側面から幼虫ではない食品に残っているため、幼虫だけを取ることを保証しなければならない。これらの幼虫は、すでに&quot;放浪第3齢段階&quot;に達している-まもなく蛹化前に-とその使用方法は、結果の解釈を複雑にします。 </li><li> 2.5％アガロースペトリ皿（他のラボは実験を通しても1％の寒天濃度を使用して、どのように準備これまでより低い濃度は、摂食第3齢幼虫）は基板に穴を掘ることができる場合があります。100ミリリットル蒸留H 2 Oで2.5グラムアガロースを溶かすそれは沸騰開始するまで電子レンジでソリューションを温める。慎重に溶液を攪拌し、すべてのアガロースが溶けるまで電子レンジに入れます。ペトリ皿の底が完全に覆われており、アガロース溶液は、滑らかな表面を形成するようなペトリ皿に熱いアガロース溶液を注ぐ。溶液を室温まで冷却し、蓋を閉じてみましょう。それが蓋に水の凝縮を可能にするであろうため、直ちに蓋を閉じないでください。 </li><li> 2M果糖ペトリ皿の調製：100mlの蒸留H 2 O（再び、1％寒天濃度の使用が可能であるが、それは第3齢幼虫は、基板に穴を掘るために供給できるようになる場合があります）に2.5グラムアガロースを溶かす。それは沸騰開始するまで電子レンジでソリューションを温める。慎重に溶液を撹拌し、マイクロに戻してくださいすべてアガロースまで波が溶解される。慎重に熱い溶液に果糖の35グラムを加える;砂糖を沸騰遅滞を避けるために、溶解するまでゆっくりと混合物をかき混ぜる。底が完全に覆われており、フルクトースアガロース溶液が滑らかな表面を形成するようなペトリ皿にホットフルクトースアガロース溶液を注ぐ。溶液を室温まで冷却し、蓋を閉じてみましょう。それが蓋に水の凝縮を可能にするであろうため、直ちに蓋を閉じないでください。 </li><li> 1 - オクタノール（10月）臭容器の調製：テフロン臭容器カスタムメイドに純粋10月10μlを記入し、臭気の蒸発を可能にするためにいくつかの小さな穴があります蓋をして閉じます。コンテナの詳細な説明はガーバーとストッカー2007に記載されている。 10月には3つの臭容器を準備します。臭容器は、挿入された化学物質の蒸発を可能にするが、幼虫が直接連絡することができないようにしてください。具体的にこのように、ここに記載された実験味覚副作用を乱すことなく、幼虫の嗅覚学習に取り組む。 </li><li>アミル（AM）の臭容器の準備：希釈は、パラフィン油で1:50 AM。カスタムメイドテフロン臭容器に希釈液10μlを記入し、臭気の蒸発を可能にするためにいくつかの小さな穴があります蓋をして閉じます。 AMの3臭容器を準備します。希釈には、2つの匂いとの間の相対的な嗜好の学習に依存する変化にマスクをかけるかもしれません他の上のいずれか臭気に対する強い選好を避けるために、すなわち、実用的な理由のために重要である。両方の臭いのために等しい魅力はナイーブな動物で後述するテスト（2.5）を適用することにより、実験前に実験室で確認する必要があるかもしれません。ここに示された値は、最近我々の研究室9,15,16によって再現されたガーバー·ラボのいくつかの出版物に基づいています。 </li><li>ペトリ皿の標識：行動実験の前にすべてのペトリ皿には、符号化されなければならない。ことを意味すること果糖を含むペトリ皿 &quot;Y&quot;または &quot;B&quot;の &quot;X&quot;又は &quot;A&quot;とアガロースのみペトリ皿に例のためにマークされなければならない。このコードは、すべてのデータが記録された後にのみ、実験者に明らかにされるべきである。 &quot;ブラインド&quot;の実験を行うことにより、実験者の期待は幼虫のパフォーマンスに影響を与えることができることは可能ではありません。我々は唯一の唯一のアガロースに提示された時に果糖ペトリ皿（+）または非報わに提示されたときのいずれか報われる条件刺激（CS1またはCS2）などの悪臭についてお話します、次の中で、幅広い読者の理解を容易にするためにシャーレ（ - ）。 </li></ol> 2。シュガー報酬訓練とテスト<ol><li>食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。水道水を数滴を含む最初のペトリ皿に移し、慎重にブラシで前後に移動します。またタップWA数滴を含む第二のペトリ皿に移すTERは食料ペーストが幼虫のbodywallに残っていないことを確認してください、そうでない場合は幼虫が実験中に食品の匂いを体験することができるであろう。これはおそらく、テスト状況における学習過程とそのパフォーマンスを不明瞭になります。 </li><li>訓練は、次の政権が適用された食欲の砂糖キューと臭いを関連付けるために幼虫を育成する。含まれているので、果糖報酬（+）ペトリ皿（ &quot;ブラインド&quot;の実験では、詳細は1.6参照用） - &quot;X&quot;のマークされたの左側と右側に10月臭容器を置きます。ペトリ皿の真ん中に30給餌第3齢幼虫の集団を入れて、蓋を閉じて、動物が10月に晒されていながら、5分間待ちます。幼虫は水滴の中に閉じ込められていませんし、それの表面張力を克服できることを確認してください。その幼虫が自由にペトリ皿に移動して、嗅覚および/または味覚刺激を体験することができます。 </li><li>トレーニング：湿らせたブラシでシャーレから幼虫を取り出して、転送したがって、アガロースのみ- （ - ）ペトリ皿を含む- &quot;Y&quot;で標識された第2のペトリ皿の上メートル、その左側と右側にあり、AM臭容器を持っています。ふたを閉め、動物は、AMにさらされながら、5分間待ちます。 </li><li>トレーニング：二回繰り返し2.2）、2.3）、そのようなすべてのこと30幼虫の経験3トレーニングサイクル：CS1 /（+） - CS2 /（ - ）; CS1 /（+） - CS2 /（ - ）; CS1 /（+） - CS2 /（ - ）。この実験では、CS1は、AM用として10月とCS2のコードを表します。 </li><li>テスト：プレイスAM 1およびアガロース専用シャーレの反対のサイトで10月1臭容器。テストのペトリ皿の中央に訓練された動物を転送します。ふたを閉め、5分間待ちます。続いて左側、テストのペトリ皿の真ん中と右側に幼生の数を数えます。 </li><li> 30摂食第3齢幼虫の第二のグループで2.5）にステップ2.1）を繰り返しますが、AMと10月の動物は、次の訓練を受けることなどの実験的な役割を交換：CS2/（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - CS1 /（ - ）; CS2 /（+） - CS1 /（ - ）。この実験では、CS1は、AM用として10月とCS2のコードを表します。 </li><li>トレーニングのための可能な配置。我々は10月/（+）のいずれかの3つのトレーニング試験の存在訓練を提示の上 - AM /（ - ）またはAM /（+）のも3訓練試行の逆数グループ内 - 10月/（ - ）。訓練中に配列依存効果を避けるためにしかし、それは完全な実験の次の繰り返しで刺激の順序を変えることが重要です。 CS1またはCS2順序、また第一又は第二の提示板で報酬プレゼンテーションを変化させることによって、訓練試行のための4つの異なる配列が可能である： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 最初のグループ </td><td> CS1 /（+） - CS2 /（ - ） </td><td> レシプロカル·グループ </td><td> CS2 /（+） - CS1 /（ - ） </td></tr><tr><td></td><td> CS1 /（ - ） - CS2 /（+） </td><td></td><td> CS2 /（ - ） - CS1 /（+） </td></tr><tr><td></td><td> CS2 /（+） - CS2 /（ - ） </td><td></td><td> CS1 /（+） - CS2 /（ - ） </td></tr><tr><td></td><td> CS2 /（ - ） - CS1 /（+） </td><td></td><td> CS1 /（ - ） - CS2 /（+） </td></tr></tbody></table>周囲の実験環境における刺激の系統的な影響を防止するためには、10月が左側に提示され、右側にAMれるように例の半分でテストを実行する必要があります。例他の半分で右に左にと10月に提示されるべきです。 3。タスクに関連した感覚運動学部のためのテスト上記の実験のデザインは独自に第3齢幼虫の餌野生型で臭気砂糖学習を分析することができます。嗅覚学習がパーに依存している場合しかし、毎日の生活のラボの研究者は、通常、比較するための幼虫の2以上の異なる実験群を使用ticular遺伝子、ニューロンの特定のセット、変異株、特別なダイエット食品、別の飼育条件、有毒な化学物質が幼虫の2以上の実験グループがテストされているすべてのケースでは1がやらなければならない、このようになど、開発時に追加された幼虫の異なるグループが適切な感覚運動acuitiesを示す場合、テストするために必須のコントロール実験のセット。潜在的な表現型が必ずしも砂糖を関連付ける臭気低減又は廃止の能力によるものではないので、これは必須になります。むしろ、潜在的な学習能力の欠陥が臭い及び/又は糖の処理における感覚運動回路のいずれかの工程での欠陥に基づくこ​​とができました。変異幼虫はセンス砂糖にできない場合、または他の言葉で、それは砂糖のメモリを確立することはできません。しかし、これは幼虫が学ぶことができないと結論することはできません。詳しくは下記の対照実験は、トランスジェニック幼虫の適切な10月、AMおよび果糖処理をテストするために行わなければならない。 1。ナイーブ10月prefeのためのテストrence 食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。アガロースペトリ皿の片側にシングル10月臭容器を入れ、ペトリ皿の真ん中に幼虫を追加蓋を閉じて、幼虫は10月に向かってシャーレや東洋にクロールできるように、5分間待つ臭気源。その後真ん中にし、テストのペトリ皿の右側に、左側に幼虫の数を数えます。 2。ナイーブAMの好みのためのテスト食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。アガロースペトリ皿の片側にシングルAM臭容器を入れ、ペトリ皿の真ん中に幼虫を追加蓋を閉じて、幼虫はAMに向かってシャーレや東洋にクロールできるように、5分間待つ臭気源。その後リットルの数を数える中間の場合、テストのペトリ皿の右側に、左側にarvae。 3。ナイーブ砂糖の好みのためのテスト食品バイアルから30給第3齢幼虫を収集します。 2.1で説明したように水道水で丁寧に洗い流してください。半分、残りの半分の2Mフルクトースアガロース混合物中に2.5％アガロースを含むペトリ皿を準備します。シャーレ上に幼虫を追加し、幼虫は果糖含有側に向かってシャーレや東洋にクロールできるように5分間、蓋を閉じて待つ。その後真ん中にし、テストのペトリ皿の右側に、左側に幼虫の数を数えます。 2分の1〜2分の1ペトリ皿の調製：セクション1.2で上記のように通常のアガロースプレートを準備します。アガロース埋めペトリ皿が冷却されると、慎重にメスで垂直軸に沿ってアガロースを切った。シャーレからアガロースの半分を削除します。 Aペトリ皿の空の半分にddはホットフルクトースアガロース溶液（製造については1.3を参照）。両半分が一致し、定義されたエッジを形成しないように注意してください-これは幼虫の選択行動に影響を与え、むしろ困難な行動分析をレンダリング4。 シャム訓練トランスジェニック給餌第3齢幼虫は10月と空気（3.1）、AMと空気（3.2）、砂糖、純粋なアガロース（3.3）、試験実験の追加セットの間に野生型レベルで区別することができるかどうかのテストにもかかわらず、最近になってきた（議論のためのガーバーやストッカー、2007を参照）を導入しました。これらの実験のための理論的根拠は以下の通りです。訓練中に巨大幼虫ハンドリングと連続匂いと砂糖の刺激を受けています。したがって、観測された学習の表現型は（ナイーブ臭気と砂糖知覚テストは、野生型のレベルにあるが！）誤解を招くことも可能である。確かに、それは可能ですので、トランスジェニック動物Dストレス抵抗性、動機、倦怠感、感覚適応、文脈学習、満腹の変化に対する野生型幼虫からiffer。したがって、ミケルスら （2005）が導入され与えられた変異体は、（1）あなたが報酬を省略して、単に両方にさらすことを除いて、トレーニング中にまったく同じように幼虫を扱う場合は、空臭容器対AM検出することが可能であるかどうか、そのテストを制御悪臭、（2）同じ政権の後10月を検出します。あなたが臭いを省略して、単に報酬を公開することを除き、訓練のような方法で幼虫を扱う場合、（3）、空臭容器対AM検出、および（4 ）同じレジメンの後に10月を検出します。包括的な議論とメソッドの詳細についてはミケルスら （2005）とガーバーとストッカー（2007）を参照してください。 4。シュガー報酬学習のためのデータ解析<ol><li>砂糖報酬学習プロトコルのデータを評価するために2つのレシプロのそれぞれについて、10月の選好指標（PREF OCT）を計算する的に訓練グループ： AM / - （ - ）10月/（+）は、受信した最初のグループのための研修： 左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の＃/ - PREF 10月（10月は+ / AM-）=（＃幼虫のAM側の＃10月側の幼虫） ： - 10月/（ - ）訓練のAM /（+）を受け取った2つ目のグループ PREF午前（AM + / 10月 - ）=（＃午前側の幼虫 - ＃10月側の幼虫）/＃すべての幼虫の左、右、中央のゾーン内</li></ol><ol start="2"><li> 4.1から2のPREF値に対する性能指標（PI））を計算します。 PIは臭いと罰被曝の摂動効果を打ち消すことによって連想的学習の時間及び取扱いの経過を表しています。 PI =（PREF 10月（10月は+ / AM）+ PREF午前（AM + / 10月））/ 2 したがって、PIは-1から1の範囲で指定できます。有意な正の値が食欲学習を記述するのに対し、有意な負の値は、嫌悪、学習表す。完全な実験は、通常10以上のPIで構成されます。データは、ボックスプロットincludinとして可視化される与えられた実験群のグラムは、すべての値。値の50％は、ボックス内に配置され、中央値性能指標は、ボックスプロット内の太線で示されている。 </li></ol> 5。タスクに関連した感覚運動学部のためのデータ解析<ol><li>適切な10月の臭気処理は次のように10月臭選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： 左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の＃/ - 臭気PREF 10月=（＃幼虫の反対側にある＃幼虫の10月側） </li><li>適切なAMの匂い知覚は次のように、AM臭選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： 臭気PREF AM =（＃午前側の幼虫 - ＃幼虫の反対側）/＃すべての幼虫の左、右、中央のゾーン内</li><li>適切な果糖知覚は次のように果糖選好指標を計算するためにテストするときにデータを評価するには： PREF果糖=（＃幼虫の果糖側 - ＃幼虫の反対側に）/＃左、右、中央のゾーン内のすべての幼虫の</li><li>偽訓練の詳細はミケルスらに与えられている。2005。 </li></ol>

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U.S.A. 94, 5131-5136 (1997).</li><li>Kitamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+modification+of+behavior+in+Drosophila+by+targeted+expression+of+a+temperature-sensitive+shibire+allele+in+defined+neurons.">Conditional modification of behavior in Drosophila by targeted expression of a temperature-sensitive shibire allele in defined neurons.</a> J. Neurobiol. 47, 81-92 (2001).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis.">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li><li>Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+electrical+properties+in+Drosophila+neurons+developing+without+synaptic+transmission.">Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission.</a> J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).</li><li>Chen, Y. C., Mishra, D., Schmitt, L., Schmuker, M., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+odor+similarity+"space"+in+larval+Drosophila.">A behavioral odor similarity "space" in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 237-249 (2011).</li><li>Saumweber, T., Husse, J., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+attractiveness+and+associative+learnability+of+odors+can+be+dissociated+in+larval+Drosophila.">Innate attractiveness and associative learnability of odors can be dissociated in larval Drosophila.</a> Chem. Senses. 36, 223-235 (2011).</li><li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae.">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. , (2011).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cAMP+response+element-binding+protein-dependent+medium-term+memory+by+appetitive+gustatory+reinforcement+in+Drosophila+larvae.">Induction of cAMP response element-binding protein-dependent medium-term memory by appetitive gustatory reinforcement in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 25, 7905-7913 (2005).</li><li>Honjo, K., Furukubo-Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+neuronal+networks+and+biochemical+pathways+for+appetitive+and+aversive+memory+in+Drosophila+larvae.">Distinctive neuronal networks and biochemical pathways for appetitive and aversive memory in Drosophila larvae.</a> J. Neurosci. 29, 852-862 (2009).</li><li>Khurana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+Conditioning+in+the+Third+Instar+Larvae+of+Drosophila+melanogaster+Using+Heat+Shock+Reinforcement.">Olfactory Conditioning in the Third Instar Larvae of Drosophila melanogaster Using Heat Shock Reinforcement.</a> Behav. Genet. 42, 151-161 (2012).</li><li>Tully, T., Cambiazo, V., Kruse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+through+metamorphosis+in+normal+and+mutant.">Memory through metamorphosis in normal and mutant.</a> 14, 68-74 (1994).</li><li>Michels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+site+and+molecular+mode+of+synapsin+action+in+associative+learning.">Cellular site and molecular mode of synapsin action in associative learning.</a> Learn Mem. 18, 332-344 (2011).</li><li>Saumweber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+synaptic+plasticity+are+impaired+upon+lack+of+the+synaptic+protein+SAP47.">Behavioral and synaptic plasticity are impaired upon lack of the synaptic protein SAP47.</a> J. Neurosci. 31, 3508-3518 (2011).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186, 735-755 (2010).</li><li>Rosenzweig, M., Kang, K., Garrity, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+TRP+channels+are+required+for+warm+and+cool+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Distinct TRP channels are required for warm and cool avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 14668-14673 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html> ショウジョウバエの幼虫の記載されているセットアップは比較的初歩脳内で連想嗅覚学習の調査を行うことが可能。アプローチでは、実験室で確立するために、シンプルな安い、簡単ですし、ハイテク機器9を必要としません。我々は、果糖の報酬11によって補強食欲連想学習を研究するために、実験のバージョンを提示します。記載されているセットアッ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> CAS番号 </td></tr><tr><td>果糖</td><td>シグマ</td><td> 47740 </td><td> 57-48-7 </td></tr><tr><td> NaClを</td><td>フルカ</td><td> 71350 </td><td> 7647-14-5 </td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td> A5093 </td><td> 9012-36-6 </td></tr><tr><td> 1 - オクタノール</td><td>シグマ</td><td> 12012 </td><td> 111-87-5 </td></tr><tr><td>アミル</td><td>シグマ</td><td> 46022 </td><td> 628-63-7 </td></tr><tr><td>灯油</td><td>シグマ</td><td> 18512 </td><td> 8012-95-1 </td></tr></tbody></table>

appetitive associative olfactory learning in drosophila larvae

以下では、 ショウジョウバエの幼虫の食欲連想嗅覚学習の方法論の詳細について説明します。セットアップでは、遺伝的干渉との組み合わせで、シンプルな幼虫の脳に特異的に連想学習の神経細胞と分子のファンダメンタルズを分析するためのハンドルを提供します。 生物が存在する動作を調整するために過去の経験を使用することができます。潜在的な行動のような買収は、メモリ·トレース1〜4として学習し、これらのポテンシャルの物理的な拠点として定義することができます。神経科学者は、これらのプロセスは、昆虫から脊椎動物5,6に至るまでモデル生物での様々な方法を用いて脳内の分子やニューロンの変化の観点でどのように構成されるかを理解しよう。そのような努力のためにそれは簡単で、実験的にアクセス可能なモデルシステムを使用すると便利です。 ショウジョウバエの幼虫はに基づいて、これらの要求を満たすことが判明しました7-10：堅牢な行動アッセイ、トランスジェニック技術の多様性と唯一の約10,000ニューロン（認知限界、いくつかの行動オプション、および疑わしい経験の豊かある程度の譲歩とはいえ）を含む神経系の基本組織の存在の可用性。 ショウジョウバエの幼虫は臭いと砂糖11月14日のような食欲の味覚補強の間のアソシエーションを形成することができる。 B.ガーバーの研究室で確立された標準的アッセイでは、動物は、二臭逆数訓練を受ける：幼虫の最初のグループは、味覚の補強材（砂糖の報酬）と一緒に臭気にさらされ、その後臭気にさらされている補強なしの9のB。補強なし臭気が発生し、その後、（砂糖報酬）補強臭気Bにさらされながら、一方で幼虫の2番目のグループは、相互の研修を受ける。以下では、両グループはTESアール2悪臭の間に自分の好みのためのテッド。パフォーマンス指標（PI）として提示 - 報わ臭気のために比較的高い嗜好は連想的学習を反映しています。パフォーマンス·インデックスの連想性質に関する結論がバラバラに臭いや味物質、そのような臭気と報酬の露出、時間と処理の経過2グループ9の間に違いはありませんなどの他のパラメータの間に不測の事態からあるので、説得力がある。

図1Aは、幼虫の嗅覚連合学習の実験手順の概要を示しています。砂糖報酬幼虫を2提示臭いのいずれかを組み合わせることで報われない匂いに比べて報わ匂いに向かって魅力的な応答を表現する潜在的な動作を取得します。幼虫の2つのグループが常にどちら臭気10月またはAMと強化子を組み合わせることで訓練されています。性能指標（PI）は相互に訓練されたグループ間の嗜好の...

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Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

ショウジョウバエの幼虫は味覚報酬で匂い刺激を関連付けることができます。ここでは、食欲の連想嗅覚学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述します。

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

appetitive-associative-olfactory-learning-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

18.9K ビュー.  University of Konstanz. ショウジョウバエの幼虫は味覚報酬で匂い刺激を関連付けることができます。ここでは、食欲の連想嗅覚学習の分析を可能にする単純な行動パラダイムを記述します。

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

神経科学

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

冷痛覚のための新規アッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.

嗅覚学習とマウスにおける差別の客観的かつ再現性のあるテスト

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

で食欲連想嗅覚学習

要約

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この動画の章

C. elegansの正ブタノンの学習、短期、および長期連想記憶アッセイ

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエモデル

に温痛覚を評価するためのローカルおよびグローバルメソッド

でProprioceptorsの可視化

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法

冷痛覚のための新規アッセイ

嗅覚学習とマウスにおける差別の客観的かつ再現性のあるテスト

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡