この技術は、ショウジョウバエメラノガスターにおける学習および記憶形成の基礎となる細胞プロセスの生理学的パラメータとしてのシナプスカルシウム活性のリアルタイムでの観察を容易にする。連想トレーニングの前後の臭いに対する神経応答を比較することで、シナプス活性と個々のフルーツハエにおける記憶痕跡の形成との間に直接的な相関関係を引き出すことができます。特定の関心ニューロンが遺伝的にコード化されたカルシウム指標を発現するトランスジェニックフルーツハエを生成するには、所望のGAL4およびUAS構造を運ぶ女性と雄のハエを横切り、エクロセクション後3〜6日まで女性の子孫を老化させる。
イメージング用のフライを準備するには、細かい鉗子を使用して、氷麻酔フライをカスタムで準備されたイメージングチャンバーに配置します。解剖顕微鏡を使用して、胸郭と脚をチャンバーの底部の電線に接触させ、頭部を平らに横たわらせます。明確な粘着テープでハエを所定の位置に固定し、外科的メスブレードを使用して頭の周りのテープの窓を切断し、アンテナを覆い、胸郭の大部分だけを露出させます。
凹凸顎で保持されている昆虫ピンを使用して、青色光硬化接着剤で頭部の側面と背面を慎重に囲みます。そして、接着剤を設定するために青色の発光LEDランプを使用してください。接着剤が完全に設定されたら、ハエヘッドの後側表面から残留未硬化の接着剤を取り除き、リンガーの溶液の滴で頭の露出したキューティクルを覆います。
非常に細かい刃の刺し傷ナイフを使用して、頭の後部を横切ってキューティクルを切り取り、オセリから始まり、各側の内側を目に切り取り、鉗子を使用して簡単に引き裂くことができるキューティクルのフラップを形成します。関心のある脳領域をブロックする可能性のある余分なキューティクルを取り除き、細かい鉗子を使用して気管の後ろ側表面を慎重にクリアし、脳組織自体の破壊を避けるように注意してください。必要に応じてリンガーの溶液を取り出してリフレッシュし、組織の破片の領域を取り除きます。
そして、ハエの頭部から約1センチメートルの皮下臭の送出針を置き、気をつけて、アンテナへの臭いの送達を妨げるものは何もない。次に、画像チャンバーを皮下臭の送達針を介して臭気供給システムに接続します。そして、フライ10分が麻酔と手術から回復することを許可します。
GFP ベースのカルシウムインジケーターの視覚化のために、赤外線レーザーと振動単離テーブルに取り付けられた水浸漬目的を搭載したマルチ光子顕微鏡のレーザーを 920 ナノメートルの励起波長に調整し、GFP バンドパス フィルターを取り付けます。コースZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンして、対象の脳領域を見つけます。スキャン時間を最小限に抑えるために、目的の領域のみにスキャンを集中させるためにcrop機能を使用してください。
そして、頭の前部が下向きになるようにスキャンビューを回転させます。次に、フレームサイズを 512 x 512 ピクセルに調整し、スキャンする領域を選択します。各フレームの計算されたスキャン時間を考慮して、少なくとも4つのヘルツのフレームレートを達成する。
臭気誘発カルシウム過渡的可視化のために、画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラムをリンクできる事前プログラムされたマクロパッケージを開始し、6.25秒間顕微鏡ソフトウェアで測定を開始してF0ベースライン値を確立します。臭気供給システムでは、特定の臭いカップバルブの開閉によって引き起こされるLEDの照明によってここに示される2.5秒の臭気刺激を提供する。臭いオフセットの終わりに記録の12.5秒が続きます。
その後、同じ方法で第二および第三の臭気の配信を繰り返します。この設定で連想調整を行うために、コンピュータ制御の臭気供給システムを使用して、12 90ボルトの感電と一緒に60秒間、条件付き刺激プラス臭を提示します。60秒の休憩の後、電感電なしで60秒間、調整された刺激マイナス臭気を単独で提示する。
トレーニングフェーズを終了した3分後に事前トレーニング臭刺激プロトコルを繰り返して、再びカルシウム一過性を誘発した後のトレーニング臭を測定する。その後、後でイメージ解析を行うために、イメージング ファイルを適切な形式で保存します。ここで代表的なキノコ本体出力ニューロン画像は、実証されるように取得が観察できる。
ニューロンの軸索コンパートメントでは発現されないdHomer-GCaMP3センサーの特定の区画化された発現は、樹状コンパートメント内の句読点信号を示す。明瞭ではあるが、チトーソリックGCaMP6fを発現するハエと比較して、dHomer-GCaMp3を発現するハエでは低振幅臭応答が観察される。ここで、1つの個々のハエからの代表的なカルシウムトレースは、個々の調製物間で得ることができる騒音レベルと振幅の差異を示す。
この技術は、細胞下レベルで視覚化する可能性、嗅覚表現がどのように変調され、コンディショニングを通じてメモリ相がどのように形成されるかを開いた。このような実験は、キノコの体のような複雑な脳構造の理解を深め、ニューロンの分布した集団全体でどのように連想記憶がどのように保存されているかを特徴付けるために不可欠です。
