Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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ダニエル陳からデジタル ビデオ生産チームのブッフホルツ高校編集ビデオで支援に感謝いたします。この気孔細胞・ プロテオミクス ・ メタボロミクス陳の実験室での研究は、米国国立科学財団 (0818051、1158000、1412547) からの補助金によってサポートされています。Wenwen 香港は中国公費によってサポートされます。博士 Qiuying パンをサポートするには、中国の奨学金委員会と国家自然科学基金、中国の (31570396)。

1. 成長する植物
<ol><li>Potting の混合物の種を発芽させます。植物を育てる成長室 140 µmol 光子 m− 2の− 1の光強度と光速で 8 h 22 ° C で 16 時間日長で暗い、18 ° C で 2 週間。</li>
	<li>4"直径の鍋土を含むに個別に類似サイズの苗を移植し、手順 1.1 で説明した追加同じ条件で 3 週間の成長します。 注: は、湿った土壌を維持する週 2 回水道水で植物を水します。</li>
</ol>2. 豊かな気孔の準備
<ol><li>5 週間の古いシロイヌナズナ植物メスと個々 の葉を削除します。</li>
	<li>裏面 (下側) に付着したワンピースと葉の向軸 (上) 側に付着した他の作品と明確スコッチ テープの 2 つの部分に各葉を取り付けます。5 葉のテープを残す s。</li>
	<li>優しい皮をむく離れて舗装と細胞と葉肉細胞の向軸側背軸側を別々 にそれぞれの手の人差し指と親指を使用してテープの 2 つの部分。</li>
	<li>気孔を開くの 60 mL に葉の背軸側から皮バッファー (50 mM KCl、10 mM MES 島、pH 6.2 1 M コに調整) 40 × 12 mm サイズ ペトリネットの場所は、収集された料理します。<ol>
<li>すべてのサンプルの皮が収集されるまでは、上記の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手順 1.1 で述べた光の条件下で生育室に皮シャーレを配置します。気孔が全開に 2 h の光の下で皮を残します。</li>
	<li>場所は、150 mm × 20 mm にペトリ皿細胞壁の消化酵素の混合 (0.7% セルラーゼ R-10、0.025% macerozyme R-10、0.1% (w/v) ポリビニルピロリドン-40、および 55% 基本的なソリューション (0.55 M ソルビトール、0.5 mM で 0.25% (w/v) ウシ血清アルブミン 50 mL を含む皮します。CaCl2, 0.5 mM MgCl2、0.5 mM アスコルビン酸, 10 μ M KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic 酸 (MES) ph 5.7 1 M コで調整)。</li>
	<li>20 分間 50 rpm でシャーレに相互シェーカーで皮を振る。</li>
	<li>20 分は、50 mL の水を含む 150 × 20 mm サイズのシャーレに皮を転送した後、皮をピンセットで酵素液から削除します。</li>
	<li>15 の皮を洗う転送ピペットを使用して、任意の残留酵素液を削除する水 10 mL で 2 回 s。</li>
	<li>手順 2.4 で使用されるバッファーを開いて新鮮な気孔の 50 mL の 150 mm × 20 mm サイズのシャーレに皮を配置するのにピンセットを使用します。手順を回復する気孔を許可する 1.1 で述べた光の条件で 1 時間インキュベートします。</li>
</ol>3. アブシジン酸 (ABA) 処理と気孔運動アッセイ
<ol><li>で 150 mm × 20 mm サイズ シャーレ。15 分 50 mL の気孔開口バッファーまたは適切な治療時間の 10 μ M の ABA の最終濃度と気孔開口バッファーの 50 mL 30 ° C で豊かな気孔皮を孵化させなさい。</li>
	<li>5, 15, 30 分間で 50 rpm シェーカーに皮を配置します。各時間間隔後ピンセットで皮を削除、手順 3.3 で画像処理の手順に従います。</li>
	<li>ABA 処理後光学顕微鏡で気孔 ABA 処理前に、と様々 な時点での画像を取る。<ol>
<li>皮を取るし、ガラス顕微鏡スライド上に置きます。</li>
		<li>顕微鏡ステージにスライドを配置し、皮のイメージを視覚化できるので、ステージを調整します。</li>
		<li>罰金を調整し、ガード細胞の鮮明な画像を得るために、顕微鏡の焦点をコースします。</li>
		<li>40 倍の倍率で複数の気孔のいくつかの画像を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ImageJ8を使用して 60 の気孔開口部を測定します。</li>
	<li>標準のエラーおよび p 値 < 0.05 60 の気孔開度測定の意義を計算します。</li>
</ol>4. 蛋白質の抽出および SDS ページの分離
<ol><li>15 の皮を挽くチルド乳鉢と乳棒を使用して皮をカバーする十分な液体窒素で s。</li>
	<li>50 皮ごと Tris 飽和フェノール (pH 8.8) の 3 mL を加えると 3 mL タンパク質抽出バッファー (0.9 M ショ糖 0.1 M トリス-HCl、0.01 M EDTA, 0.4 %2-メルカプトエタノール、プロテアーゼ、ホスファターゼ阻害剤は 1 mM の 10 μ L)、モルタルにピペットで 5 エディーの皮を挽くとヒューム フードに至り分。</li>
	<li>ピペットを使用して抽出を転送し、皮、オークリッジに金属製のピンセットを使用してチューブを遠心し、4 ° C で 1 時間を 50 rpm でシェーカーの扇動</li>
	<li>オークリッジ遠心管から皮を外し、5,000 × g で 10 分間で抽出物を遠心分離します。ピペットを使用して新しいきれいなマイクロ遠心チューブ トップのフェノール相を転送します。</li>
	<li>フェノールの沈殿物は 100% メタノールで冷たい 0.1 M 酢酸アンモニウム 5 ボリュームを追加することによってタンパク質を抽出しました。渦を簡潔にし、-20 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>4 ° C、20 分で 20,000 × g で遠心分離機、ゆっくりとチューブからそれを注ぐことによって、上清をデカントし、管内の蛋白ペレットを保持します。</li>
	<li>メタノール、酢酸アンモニウム 0.1 M で二回蛋白質餌を洗浄し、80% アセトンで 2 回と 100% 冷アセトン。 注: 洗浄は、タンパク質のチューブに指定された試薬 10 mL を追加することによって行われます。5 分、10 分の 4 ° C で 15,000 × g で遠心分離後 50 回転でシェーカーを揺り動かしなさい。その後、蛋白ペレットのみを保持チューブから試薬を注ぐ。</li>
	<li>ペレットに 100% 冷アセトン 1 mL を追加し、上下にゆっくりとピペッティングによって再サスペンドします。</li>
	<li>タンパク質サスペンション ピペット 2 mL マイクロ遠心チューブに転送し、5 分のための 4 ° C で 20,000 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>チューブからデカントでアセトンを削除し、10 分の発煙のフードでペレットを乾燥します。</li>
	<li>溶解バッファー (8 M 尿素、0.5 %sds、ph 8.5 30 mM トリス-HCl) の 200 μ L マイクロ遠心チューブにタンパク質を溶解とで 30 分間遠心 15 ° C 20 分、収集新しい管の上澄みで 20,000 × g、渦。</li>
	<li>次のタンパク質定量プロトコル9タンパク質濃度を定量化します。</li>
	<li>プロトコル10次ゲル電気泳動蛋白質の分離のための蛋白質のサンプルを使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

ガード細胞は植物におけるシグナル伝達機構を研究するためのモデル システムを研究で使用される試料の調製が生物的質問に答えるに最も適切なことを確認することが重要です。植物研究コミュニティの中で細胞の増加の関心にもかかわらずは普遍的な方法が気孔運動と生理の両方できるようになる細胞を準備する方法の 1 つで検討する分子レベルの変化だけでなく、システム。それらを分...

気孔は、全体の生理学と植物のフィットネスに重要な役割を果たします。これらの小さな植物の特定の構造、細胞として知られている 2 つの特殊な表皮細胞によって形成され、葉の切断面に最も豊富にあります。気孔は、蒸散による水損失の制御と同様、植物と大気間のガス交換の必要があります。細胞調節する異なる外部 (例えば光、湿度、病原体の接触、二酸化炭素のレベル) の統合により気孔開口部および内部 (e.g。、内因性ホルモン) 刺激1,2。過去 20 年間で、この型のセルを勉強セルシグナ リング プロセス植物のためのモデル システムとなりました。これらの細胞は葉; 総細胞のごく一部を構成します。したがって、彼らのユニークな携帯を調べるためには、生化学的および分子プロパティ単一セルにそれ、他の葉の細胞型からそれらを分離する必要。過去には、そのガード細胞研究はしばしば細胞プロトプ ラスト (GCP)3,4、5の準備を関与しています。これは通常大量のブレンドによる機械的破壊や、細胞壁分解酵素の使用を必要とし、少し収量を倍のコストと時間のかかる一般的に GCP サンプルを頻繁に準備に多くの時間がかかるように証明されています。もっと重大に、細胞は、気孔開口を調節する完全なペアとして機能、GCP の使用は細胞シグナリングを勉強するための人工的なシステムとして見ることができます。
ここでは、気孔そのまま細胞が濃縮されているし、刺激に対する生理反応を維持を準備する方法を開発しました。このメソッドは、葉肉細胞プロトプ ラスト6,7を分離するために使用された方法に触発されました。本手法は, 気孔は、明確な舗装と細胞を含む裏面層から葉の向軸レイヤーに接続されている最初葉肉細胞の大半を分離するスコッチ テープを使用して用意しています。これは葉の両側にテープを貼付し、それらを離れて剥離です。裏面層から細胞が気孔開口部バッファー内の光の下で回復が許可されます。後残りの舗装の細胞が細胞壁分解酵素、テープに濃縮されているガード細胞を残しての少量を使用して削除されます。
このシンプルなメソッドで応答性の高い有効な気孔のガード細胞迅速かつ効率的に、最小限のコストで 50 の皮から濃縮細胞を取得するより少ない時間を取って準備します。ここにメソッドは、植物細胞のプロトプ ラストが用意されて、従来よりも以下のダメージを課しています。さらに、材料はこのメソッド収量の望ましい蛋白質量から収集されます。最も重要なは、葉がブレンドにさらされていないか、長い消化時間と細胞のまま、ための研究結果より密接にガード セルの自然な生物学に関連します。この方法では、気孔運動関連付けることができますリアルタイムで分子レベルで変更します。したがって、この製法を用いた研究から得られた知識は、ガード細胞シグナル伝達のより包括的な理解のため重要となります。
モデルとして植物のシロイヌナズナを用いてください。ただしこのプロトコルは消化時間の若干の修正をナタネなど他の植物の気孔のガード細胞の濃縮に適用できます。概念の証拠として、このメソッドを介して濃縮細胞は、実行可能なフルオレセイン ・ ジアセテート (FDA) 試金および植物ホルモンのアブシジン酸 (ABA) をそれぞれ活用研究に示すように刺激に反応しました。さらに、高品質のタンパク質がこれらのガードの細胞から分離することができますを確認しました。ここでは、このプロセスの詳細なプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>Stainless Steel Surgical Scalpel</td><td>Feather&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R-10)&amp;nbsp;</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Abscisic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Companies&amp;nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

細胞の研究は、植物の全体的な機能にこのセルの型の特定の貢献の知識に不可欠です。多くの場合分離することは困難だし、挑戦を提供する従ってそれらをもっと勉強します。
本研究では、細胞濃縮法を確立します。プロトコルは、スコッチ ガードのセルを隔離し、セルからの蛋白質の抽出を採用しています。このメソッドは、分離中に整合性と細胞の収量を向上し、細胞シグナリング プロセスと気孔の表現型の関連性の研究に信頼性の高いサンプルを提供します。この方法では植物の葉はテープの 2 つの部分間で分割され背軸側を削除するには、離れて皮をむいた。このプロトコルは、シロイヌナズナ葉の組織細胞を分離するために適用されました。セルは、フルオレセイン ・ ジアセテートの生存率を決定する (FDA) とアブシジン酸 (ABA) ABA に気孔運動を評価するために扱われました。結論としては、このプロトコルは蛋白質の分離と濃縮細胞を準備するため有用証明します。有効にする生理学的およびその他の生物学的研究とタンパク質・細胞の品質はここで得られました。

シロイヌナズナの代表的なイメージは前に、と後、葉肉細胞や表皮細胞の消化は、図 1に示すセルをガードします。ガード セル実行可能性前に、と葉肉細胞と表皮細胞の除去後は、酵素活性と細胞膜の完全性 (図 1 bと1 D) を測定する FDA を使用して観察できます。図 2は、ABA の処置への応?...

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

このプロトコルでは、生理学的およびその他の生物学的研究に役立つ濃縮細胞を準備する方法について説明します。

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K ビュー.  University of Florida. このプロトコルでは、生理学的およびその他の生物学的研究に役立つ濃縮細胞を準備する方法について説明します。

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Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

免疫・感染学

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

遺伝学

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

生化学

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

環境学

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

発生生物学

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

生物学

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

シロイヌナズナにおける細菌の侵入に対する自動気孔応答測定

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

著者スポットライト:自動開口測定による気孔研究の進歩

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

要約

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全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム

全体マウントクリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

気孔テープ剥離: 細胞試料の調製法の改良

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全葉のイメージングを使用して細菌細胞をライブに気孔反応を評価する

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

シロイヌナズナの幼苗における砂糖ソリューション浸漬処理による気孔のクラスター化の誘導システム

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

Pseudomonas syringae pvに対する気孔応答の直接観察と自動測定。トマトシロイヌナズナのDC3000

全体マウントクリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色