ونحن نشكر دانيال تشن من "الرقمية الفيديو إنتاج فريق من بوشهولز المدرسة الثانوية" للمساعدة في تحرير الفيديو. دعمت هذه البحوث stomatal الحرس الخلايا والبروتينات وجميع في مختبر تشن من المنح المقدمة من "لنا المؤسسة الوطنية للعلوم" (0818051 و 1158000 و 1412547). ويدعم "مجلس المنح الدراسية الصيني" كونغ فنون. الدكتور قيوينج بانغ معتمد من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31570396).

1-زراعة النباتات
<ol><li>تنبت البذور في بوتينغ الخليط. تنمو النباتات في حجرة نمو مع شدة ضوء 140 µmol الفوتونات م2 ق 1 وكبيرة ح 8 الضوء على 22 درجة مئوية و 16 ح الظلام عند 18 درجة مئوية لمدة أسبوعين.</li>
	<li>زرع شتلات أحجام مماثلة على حدة في القطر الأواني 4 "التي تحتوي على التربة وتنمو لمدة 3 أسابيع في نفس الظروف إضافية الموضحة في الخطوة 1، 1. ملاحظة: المياه والنباتات بماء الصنبور مرتين في أسبوع للحفاظ على رطوبة التربة.</li>
</ol>2-إعداد الثغور مخصب
<ol><li>إزالة أوراق النباتات التمويل ألف- 5-الأسبوع القديمة الفردية مع مشرط.</li>
	<li>إرفاق كل ورقة إلى قطعتين من الشريط سكوتش واضحة، مع التمسك بالجانب (السفلي) أباكسيال قطعة واحدة وقطعة أخرى الانضمام إلى الجانب (العلوي) أداكسيال من الورقة. ترك الشريط على ورقة 5 s.</li>
	<li>لطيف قشر عدا قطعتين من الأشرطة باستخدام السبابة والإبهام على كل جهة لفصل الجانب أباكسيال مع الرصيف وخلايا الحرس والجانب أداكسيال مع خلايا mesophyll.</li>
	<li>مكان القشور من الجانب أباكسيال من الأوراق في 60 مل الثغور فتح المخزن المؤقت (50 مم بوكل، 10 مم مس-كوه، تعديل درجة الحموضة 6.2 مع 1 م كوه) في حجم 40 ملم × 12 ملم بيتري الأطباق كما التي تم جمعها.<ol>
<li>كرر الخطوات أعلاه حتى يتم تجميع جميع العينات القشور.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ضع أطباق بيتري المحتوية على القشور في غرفة النمو تحت ظروف الإضاءة المذكورة في الخطوة 1، 1. اترك القشور تحت الضوء ح 2 لفتح الثغور تماما.</li>
	<li>مكان القشور إلى 150 ملم × 20 ملم طبق بتري يحتوي على 50 مل جدار الخلية هضم خليط إنزيم (0.7% سيلولاسي R-10 ماسيروزيمي 0.025% R-10، 0.1% (w/v) بوفيدون-40 والبومين المصل البقري 0.25% (w/v) في الحل الأساسي 55% (0.55 م السوربيتول، 0.5 مم كاكل2، مجكل 0.5 مم2، وحمض الأسكوربيك 0.5 مم، 10 ميكرون خ2ص4، 5 ملم عدد حمض 4-مورفولينيثانيسولفونيك (MES) على درجة الحموضة 5.7 تعديلها مع 1 م كوه).</li>
	<li>اهتز القشور على شاكر المعاملة بالمثل في طبق بتري 50 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>إزالة القشور من إنزيم الحل مع الملقط بعد 20 دقيقة نقل القشور إلى طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم التي تحتوي على 50 مل الماء.</li>
	<li>استخدام ماصة نقل، شطف القشور لمدة 15 ثانية مرتين مع 10 مل الماء لإزالة أي حل الإنزيم المتبقية.</li>
	<li>استخدام الملقط لوضع القشور في طبق بتري حجم 150 ملم × 20 ملم مع 50 مل الثغور جديدة فتح المخزن المؤقت المستخدم في الخطوة 2، 4. احتضانها ح 1 في ضوء الظروف المذكورة في الخطوة 1.1 للسماح الثغور لاسترداد.</li>
</ol>3-حمض التسقيط (ABA) العلاج والفحص حركة الثغور
<ol><li>في طبق بتري حجم 150 مم × 20 مم. احتضان القشور الثغور المخصب عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال أو في 50 مل من المخزن المؤقت افتتاح ستوماتال بتركيز نهائي من 10 ميكرون أبا لوقت العلاج المناسب.</li>
	<li>وضع القشور على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 و 15 و 30 دقيقة. بعد كل فاصل الوقت إزالة قشر مع ملاقط واتبع الخطوات التصوير في الخطوة 3، 3.</li>
	<li>التقاط صور الثغور قبل العلاج أبا، وفي نقاط زمنية مختلفة بعد العلاج أبا مع مجهر ضوء.<ol>
<li>يأخذ قشر ووضعه على شريحة الميكروسكوب زجاجية.</li>
		<li>ضع الشريحة في مرحلة مجهر وضبط المرحلة بحيث يمكن تصور صورة قشر.</li>
		<li>ضبط الغرامة والتركيز على المجهر للحصول على صورة واضحة لخلايا الحرس بالطبع.</li>
		<li>تتخذ عدة صور من الثغور متعددة في 40 X التكبير.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قياس 60 فتحات ستوماتال باستخدام إيماجيج8.</li>
	<li>حساب الخطأ القياسي وأهمية في قيمة p < 0.05 من القياسات الفتحة ستوماتال 60.</li>
</ol>4-البروتين استخراج وفصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة
<ol><li>تطحن القشور لمدة 15 ثانية في النتروجين السائل ما يكفي لتغطية القشور باستخدام مدافع الهاون مبردة ومدقة.</li>
	<li>كل القشور 50، أضف 3 مل فينول تريس المشبعة (pH 8.8) المخزن المؤقت لاستخراج البروتين 3 مل (0.9 م السكروز، 0.4% 0.1 M تريس-HCl، يدتا 0.01 متر، 2-ميركابتوثانول، 10 ميليلتر من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز 1 مم) مع ماصة لقذائف الهاون وثم تطحن القشور لعدي 5 دقيقة الدولي ه في غطاء دخان.</li>
	<li>استخراج استخدام ماصة نقل والقشور استخدام ملاقط معدنية ل Oakridge الطرد المركزي أنبوب وتحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة ح 1 في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة القشور من أنبوبة الطرد المركزي Oakridge والطرد المركزي المقتطف في غ س 5,000 لمدة 10 دقائق. ثم نقل في مرحلة الفينولية العلوي إلى أنبوب تنظيف مايكرو--أجهزة الطرد المركزي جديدة باستخدام ماصة.</li>
	<li>متسرعا الفينول استخراج البروتينات بإضافة 5 مجلدات من خلات الأمونيوم 0.1 م المثلج في الميثانول 100%. الدوامة بإيجاز واحتضان بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.</li>
	<li>الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، وصب المادة طافية بصب ببطء من الخروج من الأنبوب ويحتفظ بيليه البروتين في الأنبوب.</li>
	<li>أغسل بيليه البروتين مرتين مع خلات الأمونيوم 0.1 متر في الميثانول، ومن ثم مرتين مع الأسيتون 80% ومرة مع الأسيتون البارد 100%. ملاحظة: يغسل تتم بإضافة 10 مل كاشف المحدد إلى أنبوب البروتين. تحرض على شاكر 50 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، متبوعاً بالطرد المركزي في 15,000 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم صب الكاشف خارج الأنبوبة الإبقاء فقط البروتين بيليه.</li>
	<li>أضف 1 مل الأسيتون البارد 100% لبيليه، وإعادة تعليق ببطء بيبيتينج صعودا وهبوطاً.</li>
	<li>نقل تعليق البروتين خلال ماصة لأنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 2 مل ثم الطرد المركزي في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إزالة الأسيتون بالصب عليه من الأنبوب وجاف بيليه في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>حل البروتين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي مع 200 ميليلتر من انحلال المخزن المؤقت (م 8 اليوريا، 0.5% الحزب الديمقراطي الصربي, 30 ملم تريس-HCl في الأس الهيدروجيني 8.5) ودوامه عن 30 دقيقة للطرد المركزي في 20,000 ز x عند 15 درجة مئوية 20 دقيقة وجمع المادة طافية في أنبوب جديد.</li>
	<li>قياس تركيز البروتين بعد بروتوكول تحديد مقدار البروتين9.</li>
	<li>استخدام عينات البروتين لفصل البروتين بالتفريد جل بعد البروتوكول10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

وأعلن لا تضارب في المصالح.

خلايا الحرس نظام نموذجي لدراسة آليات توصيل الإشارات في النباتات ومن المهم التأكد من أن إعداد العينات المستخدمة في هذه الدراسة هو الأكثر ملاءمة للإجابة على الأسئلة البيولوجية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بخلايا الحرس داخل مجتمع البحوث النباتية، هناك لا يوجد طريقة عالمية على كيفية إع?...

الثغور دوراً هاما في علم وظائف الأعضاء واللياقة البدنية للنباتات عموما. هذه الهياكل محطة صغيرة محددة يتم تشكيلها من قبل اثنين من خلايا البشرة المتخصصة المعروفة باسم خلايا الحرس وتم العثور على الأكثر وفرة على سطح الأوراق أباكسيال. الثغور ضرورية لتبادل الغازات بين النبات والغلاف الجوي، فضلا عن السيطرة على فقدان الماء عن طريق النتح. تنظيم خلايا الحرس الفتحة الثغور من خلال التكامل الخارجي مختلفة (مثلاً، والضوء، والرطوبة، والممرض الاتصال، مستويات ثاني أكسيد الكربون) والداخلية (على سبيل المثال.، الهرمونات الذاتية) المحفزات1،2. في السنوات العشرين الماضية، أصبح هذا النوع خلية نظام نموذجي لدراسة الخلية إشارات العمليات في مصانع. هذه الخلايا تشكل نسبة ضئيلة من مجموع الخلايا في ورقة؛ وهكذا، للتحقيق على الخلوي فريدة من نوعها، الخصائص الكيميائية الحيوية والجزيئية في طريقة وحيدة الخلية، ومن الضروري أن عزلها عن سائر أنواع خلية ورقة. في الماضي، كثيرا ما شملت الدراسات خلية الحرس إعداد خلية الحرس بروتوبلاستس (GCP)3،،من45. هذا عادة يتطلب استخدام كميات كبيرة من الإنزيمات المهينة جدار الخلية واو تعطل الميكانيكية عن طريق مزج، وقد ثبت أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لأنه يأخذ عادة عدة ساعات لإعداد عينة GCP، كثيرا ما مرات مع العائد القليل. الأهم من ذلك، لأنه بمثابة خلايا الحرس أزواج كاملة لتنظيم الفتحة الثغور، استخدام GCP يمكن اعتبار نظام مصطنع لدراسة مما يشير إلى خلية الحرس.
هنا، قمنا بتطوير أسلوب إعداد الثغور التي هي إثراء سليمة الحرس الخلايا والحفاظ على الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات. هذه الطريقة مستوحاة من أسلوب الذي تم استخدامه لعزل mesophyll خلية بروتوبلاستس6،7. في أسلوبنا، تعد الثغور باستخدام واضحة اﻻسكتلندي لأول مرة فصل غالبية الخلايا mesophyll يعلق على طبقة أداكسيال نبات من طبقة أباكسيال التي تحتوي على خلايا الحرس والرصيف. يتم ذلك عن طريق لصق قطعة من الشريط لكل جانب من النبات وتقشير لهم عن بعضها البعض. الخلايا من طبقة أباكسيال يسمح باسترداد تحت الضوء في المخزن مؤقت فتح الثغور. بعد تتم إزالة الخلايا الأرصفة المتبقية باستخدام كمية صغيرة من جدار الخلية اللاإنسانية الإنزيمات، تاركة وراءها الحرس الخلية التي يتم إثراء على الشريط.
في هذه الطريقة البسيطة، خلايا الحرس ستوماتال تكون قابلة للاستمرار وتستجيب بسرعة وكفاءة تكون مستعدة، مع أخذ أقل من ساعة واحدة للحصول على خلايا الحرس ستوماتال المخصب من القشور 50 مع أدنى حد من التكلفة. الأسلوب هنا يفرض أقل ضررا على الخلايا النباتية من الأساليب السابقة حيث يتم إعداد بروتوبلاستس. وباﻹضافة إلى ذلك، المواد التي جمعت من هذا الأسلوب الغلة البروتين المرغوب فيه المبالغ. الأهم من ذلك، لأن الورقة لا تخضع لمزج أو خلايا الحرس وأوقات الهضم طويلة تبقى على حالها، ونتائج الدراسات سوف أوثق تكون ذات الصلة بعلم الأحياء الطبيعية خلية الحرس. مع هذا الأسلوب، يمكن الربط بين حركات stomatal في الوقت الحقيقي مع التغيرات على المستوى الجزيئي. وبالتالي، سيكون من المهم إلى فهم أكثر شمولاً لخلية الحرس مما يشير إلى المعرفة المكتسبة من استخدام هذا الأسلوب في إعداد الدراسات.
كنا النبات نبات التمويل كنموذج؛ ومع ذلك يمكن تطبيق هذا البروتوكول في إثراء stomatal خلايا الحرس في الأنواع النباتية الأخرى مثل نابوس كرنب مع بعض التعديلات الصغيرة في وقت الهضم. كدليل على المفهوم، لقد أظهرنا أن خلايا الحرس ستوماتال المخصب عن طريق هذا الأسلوب ناجعة وسريعة الاستجابة للمحفزات كما هو موضح بمقايسة اسيتات (FDA) fluorescein ودراسات استخدام حمض التسقيط هرمون النبات (ABA)، على التوالي. وباﻹضافة إلى ذلك، أثبتنا أن البروتينات عالية الجودة يمكن أن تكون معزولة من هذه الخلايا الحرس. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لهذه العملية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

دراسة خلايا الحرس ضروري لمعرفة المساهمات المحددة لهذا النوع من الخلية للدالة الشاملة للنباتات. ومع ذلك، غالباً ما يصعب عزل وهكذا دراستها غالباً ما يوفر تحديا.
تحدد هذه الدراسة أسلوب إثراء stomatal حارس خلية. ويستخدم البروتوكول اﻻسكتلندي لعزل خلايا الحرس واستخراج البروتينات من الخلايا. هذا الأسلوب يحسن السلامة والعائد لحراسة الخلية أثناء العزل وتوفر نموذج موثوق بها لدراسة عمليات إرسال الإشارات في الخلية، وكيفية الربط بين حركة ستوماتال تعمل. في هذا الأسلوب، أوراق النبات تم تقسيمه بين جزأين من الشريط ومقشرة بعيداً لإزالة الجانب أباكسيال. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة أوراق نبات لعزل خلايا الحرس. الخلايا تعامل مع فلوريسسين اسيتات (FDA) لتحديد جدوى وحمض التسقيط (ABA) لتقييم حركة الثغور في الاستجابة لرابطة المحامين الأمريكية. وفي الختام، يثبت هذا البروتوكول مفيدة لإعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب وعزل البروتينات. الحصول على نوعية الخلايا والبروتينات هنا تمكين الفسيولوجية والدراسات البيولوجية الأخرى.

صورة تمثيلية لنبات الحرس الخلايا قبل وبعد الهضم mesophyll وخلايا البشرة ويرد في الشكل 1. ويمكن ملاحظة صلاحية خلية الحرس قبل وبعد إزالة mesophyll وخلايا البشرة باستخدام إدارة الأغذية والعقاقير لقياس النشاط الأنزيمي وسلامة غشاء الخلية (الشكل 1 باء و...

Watch this Scientific Journal Video about Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation at JoVE.com

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  University of Florida. هذا البروتوكول وصف أسلوب إعداد خلايا الحرس ستوماتال المخصب مفيد للدراسات البيولوجية الفسيولوجية وغيرها.

Video: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

إعداد Pyrophosphates إينوسيتول الجودة

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...