Name: stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
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우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.

1. 성장 하는 식물
<ol><li>Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.</li>
	<li>4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주. 참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.</li>
</ol>2입니다. 풍부한 Stomata의 준비
<ol><li>메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.</li>
	<li>원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.</li>
	<li>부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.</li>
	<li>장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질 40 m m × 12 m m 크기 페 트리 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2 1 m 코 조정) 버퍼링은 수집 된 요리.<ol>
<li>모든 샘플 껍질 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.1 단계에 명시 된 빛 조건에서 성장 챔버에 껍질을 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. Stomata를 완전히 여 2 h에 대 한 빛 아래 껍질을 남겨 주세요.</li>
	<li>장소는 150 m m x 20 m m 소화 효소 혼합물 (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40, 및 0.25% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 55% 기본 솔루션 (0.55 M sorbitol, 0.5 m m에서에서 세포 벽의 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 껍질 CaCl2, 0.5 m m MgCl2, 0.5 m m 의약품, 10 µ M KH2포4, 5 mM 4 morpholineethanesulfonic 산 (MES) pH 5.7에서 1 m 코 조정).</li>
	<li>20 분 50 rpm에서 배양 접시에 상호 통에 껍질을 흔들어.</li>
	<li>껍질에서에서 제거 효소 솔루션 핀셋으로 후 20 분 물 50 mL를 포함 하는 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 전송 합니다.</li>
	<li>15 대 한 껍질을 씻어 전송 피 펫을 사용 하 여, 모든 잔여 효소 솔루션을 제거 하는 물 10 mL로 두 번 s.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 단계 2.4에서에서 사용 되는 버퍼를 열고 신선한 stomata의 50 mL와 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 배치. 1 h 단계 복구 stomata 있도록 1.1에서에서 명시 된 조명 조건에 대 한 품 어.</li>
</ol>3. Abscisic 산 (ABA) 치료 및 Stomata 움직임 분석 결과
<ol><li>150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 15 분 stomatal 개통 버퍼의 50 mL 또는 stomatal 개통 버퍼의 적절 한 치료 시간이 10 µ M ABA의 최종 농도 50 mL 30 ° C에서 풍부한 stomata 껍질을 품 어.</li>
	<li>5, 15, 30 분 동안 50 rpm에서 통에 껍질을 놓습니다. 각 시간 간격 후 핀셋으로 껍질을 제거 하 고 단계 3.3 이미징 단계를 따릅니다.</li>
	<li>가벼운 현미경으로 ABA 치료 후 stomata ABA 치료 전과 다양 한 시간 점에서 이미지를 받아.<ol>
<li>껍질을가지고 고 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.</li>
		<li>슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 무대를 조정 하는 껍질의 이미지를 시각화할 수 있습니다.</li>
		<li>벌금을 조정 하 고 가드 셀의 깨끗 한 이미지를 현미경에 집중 코스.</li>
		<li>40 X 확대에서 여러 stomata의 여러 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>60 stomatal apertures ImageJ8를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>표준 오류 및 p-값 < 0.05 60 stomatal 조리개 측정의 의미를 계산 합니다.</li>
</ol>4. 단백질 추출 및 SDS 페이지 분리
<ol><li>15 대 한 껍질을 갈아 냉장된 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 껍질을 충당 하기 위해 충분 한 액체 질소에 s.</li>
	<li>50 껍질 당 포화 트리 스 페 놀 (pH 8.8)의 3 개 mL를 추가 및 3 mL 단백질 추출 버퍼 (자당 0.9 M, 0.1 M Tris HCl, 0.01 M EDTA, 0.4 %2-Mercaptoethanol, 1mm 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물의 10 µ L) 박격포를 피 펫을 다음 5 addi의 껍질을 갈아 증기 두건에서 tional 분입니다.</li>
	<li>추출은 피 펫을 사용 하 여 전송 하 고는 오크에 금속 핀셋을 사용 하 여 껍질 원심 관 50 rpm에서 1 h 4 ° c.에 대 한 통에 선동</li>
	<li>오크 릿지 원심 분리기 튜브에서 껍질을 제거 하 고 원심 10 분 동안 5000 x g에서 추출. 다음 전송 최고 페 놀 단계는 피 펫을 사용 하 여 새로운 깨끗 한 마이크로 원심 튜브.</li>
	<li>침전은 페 놀 100% 메탄올에 얼음 처럼 차가운 0.1 M 염화 아세테이트의 5 볼륨을 추가 하 여 단백질을 추출. 짧게 소용돌이 하룻밤-20 ° c.에 품 어</li>
	<li>20 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 centrifuge, 천천히는 튜브 붓는 여는 상쾌한 가만히 따르다 고 튜브에 단백질 펠 릿을 유지 합니다.</li>
	<li>메탄올에 0.1 M 염화 아세테이트로 두 번 단백질 펠 릿을 세척 그리고 두 번 80% 아세톤과 함께 한 번 100% 찬 아세톤. 참고: 세척 단백질의 튜브에 지정 된 시 약의 10 mL를 추가 하 여 수행 됩니다. 5 분, 10 분 동안 4 ° C에서 15000 x g에서 원심 분리 뒤 50 rpm에서 통에 교 반 하십시오. 그런 다음 튜브만 단백질 펠 릿을 유지 시 약을 붓는 다.</li>
	<li>펠 릿을 100% 찬 아세톤의 1 mL을 추가 하 고 다시 천천히 위아래로 pipetting으로 일시 중단.</li>
	<li>2 mL 마이크로 원심 관에 피 펫을 통해 단백질 정지를 전송 후 5 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 원심.</li>
	<li>튜브에서 decanting 하 여 아세톤을 제거 하 고 10 분 동안 증기 두건에서 펠 릿 건조.</li>
	<li>마이크로 원심 튜브 해산 버퍼 (8 M 요소, 0.5 %SDS, pH 8.5에서 30 mM Tris HCl)의 200 µ L에서에서 단백질 분해와 20000 x g 20 분 및 수집 새로운 튜브에 상쾌한 15 ° c에서 30 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이.</li>
	<li>다음 단백질 정량화 프로토콜9단백질 농도 계량.</li>
	<li>단백질 분리에 대 한 단백질 견본을 사용 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜10다음으로.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기...

Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.
여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.
이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.
우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Stainless Steel Surgical Scalpel</td><td>Feather&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R-10)&amp;nbsp;</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;PI78443</td><td></td></tr><tr><td>Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein Quantitation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Diacetate (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Abscisic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Companies&amp;nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tube (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.
이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 ...

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K 조회수.  University of Florida. 이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

비디오: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

연구

면역학 및 감염병학

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

유전학

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

생화학

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...

환경과학

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

발생학

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

생물학

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

애기장대(Arabidopsis)의 박테리아 침입에 대한 자동 기공 반응 측정

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

저자 스포트라이트: 자동 조리개 측정을 통한 기공 연구 발전

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

요약

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전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000

Pseudomonas syringae pv에 대한 기공 반응의 직접 관찰 및 자동 측정. 토마토 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 DC3000