著者は、貴重なコメントや原稿の徹底的な読み込みのため S Y チェ (大学校) をありがとうございます。この作品は、忠南大学校の研究基金によって支えられました。

1. 遺伝子 Subcloning
<ol><li>PEUI(+) の MCS の認識、適切な制限の酵素のサイト (またはサイト) を選択し、目的の方向 (図 1) の興味の遺伝子を subclone します。 注: EGFPまたはフラグ エピトープ タグ アンキリンリピート ドメイン 13A (ANKRD13A) 遺伝子のシーケンスや結紮-独立したクローニング法19T4 DNA ポリメラーゼを用いた pEUI(+) ベクターの EcoRI サイトだった subcloned。</li>
	<li>EcoRI で 37 ° C で 1 時間の pEUI(+) をリニア化します。ミックス 50 ng/μ L の 40 ng/μ L の PCR 増幅EGFPまたはANKRD13Aと pEUI(+) を線形し、T4 DNA ポリメラーゼ (1 U) (RT) 前に室温で 10 分間氷の上潜伏 1 分と追加 10 μ L の 100 μ L に直接反応混合物の反応次の変換の DH10B 有能なセルを実験します。 注: pEUI(+) (図 1 b) の MCS に追加されましたいくつかの制限酵素認識部位が、お勧めします EcoRI サイトにターゲット遺伝子を subcloning 結紮独立クローン技術19,20を使用しています。</li>
	<li>シーケンスによる挿入を確認し、トランスフェクションに適した DNA 精製キットを使用して DNA を浄化します。</li>
</ol>2. トランスフェクションと Teb の治療
<ol><li>5-10% ウシ胎児血清 (FBS) と抗生物質 (100 U/mL ペニシリン, 100 μ g/mL ストレプトマイシン) 補われるダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) の 5 mL の新鮮な継代の HEK293 細胞を含む 4 細胞培養皿 (直径 60 mm) を準備します。以下、「培」または単に「培」は、FBS と抗生物質 DMEM を表します。37 ° C で HEK293 細胞を維持します。</li>
	<li>1 μ g の精製 DNA をトランスフェクション試薬の 3 μ L を使用して 50-60% の密度を HEK293 細胞に transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 200 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。、Transfection のため 2 つの料理を使用し、他の 2 つのコントロールとして放置のまま。</li>
	<li>トランスフェクションの 12-24 時間後に、トランスフェクションのサンプルの 1 つと非 transfected コントロールの 1 つに Teb (最終濃度 0.2 - 10 µmol) を追加します。未処理の実験的コントロールとその他の 2 つのサンプルをまま。 注: Teb 原液 (ジメチルスルホキシドに溶解し 50 mM) は、細胞培養液、DMEM、またはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 培養細胞実験的パラメーターに応じて追加する前に適切な濃度で希釈できます。しかし、水溶液中における溶解 Teb の低度のため媒体の Teb の高濃度マスター ミックスの準備を避ける代わりに、完全な細胞培養液を必要な濃度で新鮮な培 Teb に置き換えます。</li>
	<li>37 ° C で 12 48 h の Teb 処理と未処理細胞を養う</li>
	<li>挿入EGFPを使用して蛍光顕微鏡 (図 2) の EGFP 発現を分析します。そうでなければ、免疫ブロット分析法のための細胞を収穫します。<ol>
<li>免疫ブロット分析法の氷冷 PBS で 2 回細胞を洗い、それから細胞スクレーパーを使用してそれらをこすり。</li>
		<li>セルを重ね、18-25 ° C (RT) で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に収穫を回転させます。</li>
		<li>PBS を完全に破棄した後の冷えた哺乳類タンパク質抽出試薬 0.5 mL を追加 (M-ごと)、プロテアーゼ阻害剤 (プロテアーゼ阻害剤のカクテル 100 の 5 μ L) 場合は、60 mm ディッシュに培養される細胞ペレットと一緒に。</li>
		<li>再ピペッティングのいくつかのラウンドでセルを中断し、18-25 ° C (RT) で 15 分の浮遊細胞をインキュベーションしています。</li>
		<li>細胞の 4 ° C で 10 分間 21,000 x g でライセートをスピンします。</li>
		<li>新鮮な 1.5 mL 遠心チューブに水溶液上澄みを転送します。</li>
		<li>イムノブロット、次の標準的なプロトコルに適切な抗体培養上清を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. pEUI(+) 遺伝子スイッチのゲノムの統合と安定した HEK293 細胞ラインの生成
<ol><li>トランスフェクション試薬の 15-30 μ L を使用して 90 mm 直径細胞培養皿の 50-60% の合流は、HEK293 細胞に遺伝子の精製 pEUI(+) の 5-10 μ g を transfect します。トランスフェクション試薬を加える (FBS、抗生物質なし DMEM) の希釈液 500 μ L の DNA を含んでいます。室温で 30 分間反応混合物の培養後 HEK 293 細胞培養皿上に混合物を追加します。</li>
	<li>後、成長し、37 ° C で 24-48 時間 (ピューロマイシン) なし非選択性培下ピューロマイシン耐性遺伝子産物を表現する形質転換細胞を許可します。</li>
	<li>新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培養液を破棄した後に予め温めておいた PBS (37 ° C) の形質転換細胞をすすぎ、0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた培 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。</li>
	<li>予め温めておいた培 (37 ° C) および 90 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 10 mL の 50 mL で、形質転換細胞は再中止します。ピューロマイシン治療前に、の 50-60% の confluency まで 37 ° C で細胞の培養 (一般に、これは約 24-48 時間かかる)。</li>
	<li>37 ° c、3-4 週間 3 μ G/ml ピューロマイシンを添加した細胞培養液で形質転換細胞を養います。選考期間中、選択圧を維持するために 2 〜 3 日ごとピューロマイシン (3 μ g/mL) を含む培養液を変更します。セルになると完全に合流、ピューロマイシンを含む培養液中で、3.3 3.4 の手順を次に、それらを分割します。必要でない場合は、培養液の残りのセルを破棄します。 注: ピューロマイシン選択条件は、特定の細胞型の実験確立する必要があります。細胞培養; ピューロマイシンの 3 μ g/mL を使いました。これは非 transfected HEK293 細胞死を誘発するのに十分だった。</li>
	<li>クローニング シリンダーを使用して個々 のコロニーから細胞を収穫し、製造元の指示に従ってください。<ol>
<li>細胞培養液を破棄します。予め温めておいた (37 ° C) 浮遊細胞を削除する PBS で 2 回プレートをすすいでください。</li>
		<li>滅菌鉗子を使用すると、個々 のコロニーにクローニング シリンダーを設定します。</li>
		<li>各シリンダーに 0.35% トリプシン/EDTA の 0.2 mL を追加します。</li>
		<li>セルがデタッチされると、シリンダーに予め温めておいた (37 ° C) 培養液を数滴を追加するまでは、1 分の 37 ° C で皿を孵化させなさい。</li>
		<li>それぞれのシリンダーから培養液 2 mL と 1 μ G/ml の各ウェルにピューロマイシン 6 ウェル プレートの個々 の井戸にセルを転送します。 注: 細胞がコンフルエントになると、文化をスケール アップ。クローンが設けることができるようになりました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピューロマイシンの 1 μ G/ml を添加した細胞培養液中の個々 のクローンを維持します。</li>
	<li>イムノブロットと遺伝子の発現レベルを分析することによって 24 時間テストの Teb 治療 (最終濃度、10 μ M) への感度、Teb にクローンの応答をテストすることによって、個々 のコロニーを検証します。目的のクローン (またはその複製) を選択します。遺伝子の誘導レベルを分析する前に Teb 扱われ、37 ° C で 12-48 時間培養培地で未処理のサンプルを栽培してください。2.5.1 - 2.5.7 の手順」の手順に従って、免疫ブロットを遺伝子の発現レベルを測定できます。</li>
</ol>4. Teb の枯渇
<ol><li>Teb 自由な媒体 Teb 含む細胞培養液に置き換えて Teb 刺激を癒します。 注: 最初新しい培養皿上に細胞を再シードすることがなく成長媒体を交換することをお勧めします。残留 Teb はプラスチックの皿に固執する表示され、遺伝子の強力な背景表現を引き出すでしょう。新しい培養プレート上のセルを再シード、前に数回培地または PBS で収穫された細胞をすすいでください。<ol>
<li>新鮮で培養皿からセルを切り離して考えます。培地を含む Teb を破棄した後リンスの Teb 刺激細胞に予め温めておいた PBS (37 ° C) で 2 回、0.25% トリプシン/EDTA の 1 つの mL を追加、37 ° C で 1 分間インキュベート予め温めておいた Teb 無料培養液 (10 mL、37 ° C) を追加することによってトリプシン/EDTA を焼入れ後 18-25 ° C で 2 分間 21,000 × g で 15 mL の円錐管に遠心分離によって続いて細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。</li>
		<li>予め温めておいた Teb 無料培 (37 ° C) と 3 つの 60 mm 新鮮な細胞培養皿に転送セルの 5 mL の 50 mL のセルを再停止します。それぞれ 24、48、および 72 h の 37 ° C での細胞を培養します。</li>
		<li>異なる時点で細胞を収穫し、免疫ブロットを使用して遺伝子の発現レベルを測定します。 注意: これらの実験条件下での遺伝子発現の検出不可能な Teb 自由な文化媒体 (図 3) のセルの約 3 日後文化なりました。イムノブロット 2.5.7 2.5.1 - の手順に従って導入遺伝子の発現レベルを測定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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我々 は本レポートに関する利害の対立があります。

バイナリの遺伝子発現のスイッチを使用しての主な欠点は同時に目的セルに 2 つの独立したプラスミド (ドライバーとエフェクター) を提供する必要があります。これはプラスミドと誘導1,2,3スイッチの矛盾した応答の結果の不平等な配分につながることができます。2 ベクター システムの別の欠点は、抗生物質の選択の 2 ...

いくつかの異なる遺伝子のスイッチは、正確に遺伝子発現細胞培養および動物モデル、成功1,2,3の度合いを調節する能力について検討しています。潜在的な遺伝子のスイッチ システムを含む、いくつかの厳格な条件を満たす必要があります: 遺伝子、誘導、プロモーターのごくわずかな水漏れしたため、transgene の可逆性の用量と時間依存応答性の正確な方向式インデューサの除去や細胞および研究室動物1,2,3に許容インデューサ毒性レベルを介して活性化。テトラサイクリン4、5ラパマイシン6,7、8ミフェプリストン9,10を含むいくつかの小分子誘導を悪用されています。エクダイソン11,12,13,14。一般に、これらのシステムは、2 つまたは 3 つの離散式ユニットを含む、少なくとも 2 つのプラスミドを必要とする、1 つまたは 2 つの構成; 転写活性を得るために小分子インデューサをバインド規制要素 (インデューサ プラスミッド)別プラスミド (エフェクター プラスミッド) インデューサ バインド規制要素へのアクセスを可能にする規制 DNA 領域の制御の下で遺伝子を含みます。バイナリ システムの主な欠点は、ターゲット セル (インデューサとエフェクター) 2 つのベクトルの併用導入を必要とすることです。一時的な遺伝子発現実験の 2 種のプラスミドの同時トランスフェクション必然的を生成する単独でインデューサか、エフェクターをトランスフェクトしたまたは co transfected ない均等にするセルの人口。さらに、バイナリ システムでは、時間がかかり、骨の折れるである安定したセルラインを確立する抗生物質選択の少なくとも 2 つのラウンドが必要です。したがって、遺伝子発現に必要なすべてのコンポーネントを組み合わせることと 1 つのベクトルに規制が単一のセルにすべての必要な要素の随伴表現を保証し、遺伝子発現の調節を可能にする理想的だろう小分子誘導と治療を通じて
バイナリの遺伝子スイッチの欠点を克服するためには、キイロショウジョウバエEcR 遺伝子誘導システム15を使用して特異遺伝子スイッチ我々 最近開発。エクジソンは、順番 DNA 規制要素3,11EcR のバインディングを誘導する EcR/ウルトラスピラクル (USP) ヘテロダイマーにバインドするときに遺伝子発現を仲介します。脊椎動物のレチノイド X 受容体 (RXR)、昆虫、USP のオーソログがアクティブな転写活性化因子16を形成する EcR を募集します。したがって、脊椎動物の細胞または組織の遺伝子発現のターゲット、EcR と RXR 必要があります共発現同時に脱皮ホルモンまたはそのアゴニストによって刺激されて前に。以来、EcR 遺伝子スイッチのヘテロ二量体の機能は、内因性の RXR レベル、Padidamらによって影響があります。異種 GAL4 DNA 結合、単純ヘルペス ウイルス蛋白質 vmw65 置き換え EcR DNA 結合と活性化ドメイン (VP16) 活性化ドメイン融合内因性 RXR に応答しなくなったし、ホモを形成した EcR リガンド結合ドメイン転写活性17を得よう。EcR ベース遺伝子のスイッチは、ホモを形成し、エクジソン アゴニスト、Teb16のない状態で細胞質に局在 GvEcR と組み合わせて最小限 VP16 活性化ドメインから成るキメラ蛋白質を構築することでさらに改善されました。 18。Teb にバインディングによって、GvEcR、内局細胞質からに変更ゼブラフィッシュ E1b 10 タンデム併用最小プロモーターから成るハイブリッド プロモーターの反復上流活性化配列 (UASs) を開始するを認識する核、16ターゲット遺伝子のトランスクリプション。
以前に報告した EcR 遺伝子を簡素化するスイッチ16,18、刺激的な発現のためすべての必要な要素を装備し、指定の単一ベクトルにシステムのバイナリの機能を結合我々新しく生成されたベクトル pEUI(+) (GenBank 受入番号: KP123436、図 1 a)15。EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の認識シーケンスが (図 1 b) UAS を繰り返す多重クローニング サイト (MCS) 続いて E1b 最小プロモーターの横にある 10 のタンデムのエフェクター GvEcR ドライバー (ドライバー以下) への応答で構成されます。選択を容易にするためにさらに、トランスフェクション細胞の SV40 プロモーターに駆動されるピューロマイシンN-アセチルのトランスフェラーゼ (PAC) 遺伝子は安定したセルライン (図 1) を維持するためにドライバーとエフェクターの間置かれました。
PEUI(+) を用いた遺伝子発現の非定常かつ安定的な変調のための詳しいプロトコルについて述べる。また、脱皮ホルモンのアゴニストとして Teb の正しく使用するための詳細な手順を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pEUI(+)</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The patent license was transferred to TransLab Inc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gene-Fect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:71px;">TransLab</td>
			<td style="width:119px;">TLC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293</td>
			<td style="width:71px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tebufenozide</td>
			<td style="width:71px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Puromycin</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotics</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">LM001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Welgene</td>
			<td style="width:119px;">S001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell culture dish</td>
			<td style="width:71px;">SPL life science</td>
			<td style="width:119px;">11090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse FLAG M2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-alpha tubulin antibody</td>
			<td style="width:71px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">CP06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cloning cylinder</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS31668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td style="width:71px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:119px;">740410.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-PER Mammalian Protein 
			Extraction Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">78505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Protease inhibitor Cock. III</td>
			<td style="width:71px;">T&#38;I</td>
			<td style="width:119px;">BPI-9200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

遺伝子発現の精密制御が望ましい生物学的および臨床的研究です。ただし、現在失業遺伝子スイッチのバイナリの機能は、単一のセルに同時に 2 つの治療式単位の転送を必要とするため、遺伝子治療のためのシステムの実用的なアプリケーションが制限されます。遺伝子組み換え式システムを簡素化し、1 つのベクトルで遺伝子発現モジュールの完全なセットを包括的な pEUI(+) として示される遺伝子スイッチを生成されます。新開発の特異遺伝子のスイッチは非常に GAL4 DNA 結合ドメインの構成と変更された EcR (GvEcR)、変更されたショウジョウバエ脱皮ホルモン受容体 (EcR) と同様、GAL4 DNA 結合ドメインと融合した最小限 VP16 活性化ドメイン時間と用量依存的に化学インデューサの管理に対応。PEUI(+) ベクターは、生物学的研究と前臨床研究遺伝子発現の制御を改善するための強力なツールです。ここでは、変調テブフェノジド (Teb) 処理による pEUI(+) ベクトルを用いた非定常かつ安定的な発現のための詳しいプロトコルを提案する.また、Teb の化学誘導としての使用に関する重要なガイドラインを紹介します。

GvEcR ベースの特異遺伝子のスイッチは、図 1 aに描かれています。PEUI(+) ベクトルは、Teb で処理による遺伝子発現の調節用に最適化されました。PEUI(+) のエフェクター地域、10xUAS と最小プロモーターに続いて EcoRI、PmlI、NheI、BmtI、AfeI、および AflII の制限酵素認識部位を含む MCS、E1b で構成します。SV40 多信号は、MCS (図 1 b) ?...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K ビュー.  Chungnam National University. ここでは、テブフェノジド処理による pEUI(+) 特異遺伝子スイッチを用いた遺伝子発現の調節のためのプロトコルを提案する.

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

遺伝学

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell activation, stress, or stimulation. Single-cell multiplex gene expression enables the simultaneous assessment of tens of genes1,2,3. At the single-cell level, multiplex gene expression determines population heterogeneity4,5. It allows for the distinction of population heterogeneity by determining both the probable mix of diverse precursor stages among mature cells and also the diversity of cell responses to stimuli.
Innate lymphoid cells (ILC) have been recently described as a population of innate effectors of the immune response6,7. In this protocol, cell heterogeneity of the ILC hepatic compartment is investigated during homeostasis.
Currently, the most widely used technique to assess gene expression is RT-qPCR. This method measures gene expression only one gene at a time. Additionally, this method cannot estimate heterogeneity of gene expression, since multiple cells are needed for one test. This leads to the measurement of the average gene expression of the population. When assessing large numbers of genes, RT-qPCR becomes a time-, reagent-, and sample-consuming method. Hence, the trade-offs limit the number of genes or cell populations that can be evaluated, increasing the risk of missing the global picture.
This manuscript describes how single-cell multiplex RT-qPCR can be used to overcome these limitations. This technique has benefited from recent microfluidics technological advances1,2. Reactions occurring in multiplex RT-qPCR chips do not exceed the nanoliter-level. Hence, single-cell gene expression, as well as simultaneous multiple gene expression, can be performed in a reagent-, sample-, and cost-effective manner. It is possible to test cell gene signature heterogeneity at the clonal level between cell subsets within a population at different developmental stages or under different conditions4,5. Working on rare populations with large numbers of conditions at the single-cell level is no longer a restriction.

This protocol describes how to assess the expression of a large array of genes at the clonal level. Single-cell RT-qPCR produces highly reliable results with a strong sensitivity for hundreds of samples and genes.

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

要約

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

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内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出