Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

Die Autoren danken für wertvolle Kommentare und gründlichen Lektüre unserer Handschrift S-Y Choi (Chonnam National University). Diese Arbeit wurde durch einen Forschungsfonds der Chungnam National University unterstützt.

1. Subcloning Transgen
<ol><li>Wählen Sie eine entsprechende Restriktionsenzym Anerkennung Seite (oder Seiten) in der MCS pEUI(+) und subclone das Gen des Interesses in die gewünschte Richtung (Abbildung 1). Hinweis: Wiederholen Sie EGFP oder Flagge Epitop-Tags Ankyrin-Repeat-(AR)-Domäne 13A (ANKRD13A) Transgen EcoRI Standort des pEUI(+)-Vektors mit T4-DNA-Polymerase in einer Sequenz-Ligatur unabhängig und Klonen Methode19subcloned wurde.</li>
	<li>Linearisieren der pEUI(+) mit EcoRI für 1 h bei 37 ° C. Mix 50 ng/µL linearisiert pEUI(+) mit 40 ng/µL des PCR verstärkt EGFP oder ANKRD13A, und reagieren mit T4-DNA-Polymerase (1 HE) für 1 min bei Raumtemperatur (RT) vor der Inkubation auf Eis für 10 min. Fügen Sie 10 µL des Reaktionsgemisches direkt mit 100 µL DH10B kompetente Zellen für die folgende Transformation experimentieren. Hinweis: Obwohl die MCS pEUI(+) (Abbildung 1 b) mehrere Anerkennung Beschränkungsenzymsites hinzugefügt wurden, empfehlen wir das Zielgen in die EcoRI-Website subcloning Ligatur-unabhängige Klonen Technologie19,20.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Einlage durch Sequenzierung und dann reinigen Sie die DNA mit einem DNA-Reinigung-Kit zur Transfektion geeignet ist.</li>
</ol>(2) Transiente Transfektion und Teb Behandlung
<ol><li>Bereiten Sie vier Zelle Kultur Gerichte (60 mm Durchmesser) mit frisch passagiert HEK293 Zellen in 5 mL Medium Dulbeccos modifizierten Eagle (DMEM) ergänzt mit 5-10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Antibiotika (100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin). Im folgenden stellt "Zellkulturmedium" oder einfach "Nährboden" der DMEM mit FBS und Antibiotika ergänzt. Pflegen Sie die HEK293 Zellen bei 37 ° C.</li>
	<li>Transfizieren Sie 1 µg der gereinigte DNA in HEK293 Zellen bei 50-60 % Dichte mit 3 µL Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 200 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale. Verwenden Sie zwei Gerichte zur Transfektion, und lassen Sie die anderen beiden unbehandelt als Steuerelemente.</li>
	<li>Fügen Sie nach 12-24 h Transfektion Teb (Endkonzentrationen, 0,2 - 10 µmol) zu einem der transfizierten Proben und eines der Steuerelemente nicht transfiziert. Lassen Sie die anderen beiden Proben als experimentelle Kontrolle unbehandelt. Hinweis: Der Teb-Stammlösung (50 mM in Dimethyl Sulfoxid aufgelöst) kann im Zellkulturmedium, DMEM oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine geeignete Konzentration vor der kultivierten Zellen abhängig von den experimentellen Parameter hinzufügen verdünnt werden. Vermeiden Sie jedoch durch die geringe Löslichkeit des Teb in wässriger Lösung, Vorbereitung einen master-Mix mit einer hohen Konzentration von Teb in Medium; Stattdessen ersetzen Sie die komplette Zellkulturmedium mit frischen Teb auf die gewünschte Konzentration-haltigem Medium.</li>
	<li>Pflegen der Teb-behandelten und unbehandelten Zellen für 12-48 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Wenn mit EGFP einfügen, analysieren Sie EGFP Ausdruck unter dem Fluoreszenz-Mikroskop ( Abbildung 2). Ansonsten Ernten der Zellen für eine Immunoblotting-Assay.<ol>
<li>Spülen Sie für die Immunoblotting-Assay die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS und dann kratzen sie heraus mit einem Schaber Zelle.</li>
		<li>Für die Zellen häufen, spin-down die Ernten in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Nach der PBS komplett verwerfen, hinzufügen 0,5 mL eiskaltes Säugetier-Protein Extraktion Reagenz (M-pro), zusammen mit Protease-Inhibitor (5 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail), um das Diabolo, wenn die Zellen in einer 60 mm Petrischale kultiviert werden.</li>
		<li>Wieder auszusetzen Sie, die Zellen mit mehreren Verhandlungsrunden pipettieren und inkubieren Sie die suspendierten Zellen für 15 min bei 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Drehen Sie die Zelle lysate 21.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Übertragen Sie die wässrigen Überstands zu einem frischen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Den Überstand durch Immunoblotting, folgende standard-Protokolle mit entsprechenden Antikörpern zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generation von stabilen HEK293 Zelllinien mit genomischen Integration der pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfizieren Sie 5-10 µg des gereinigten pEUI(+) mit das Transgen in HEK293 Zellen, die 50-60 % Zusammenfluss in der Kulturschale 90 mm Durchmesser Zelle mit 15-30 µL des Transfection Reagens. Die Transfektion Reagenz zu 500 µL des Verdünnungsmittels (DMEM ohne FBS und Antibiotika) hinzufügen, die die DNA enthält. Fügen Sie nach der Inkubation der Reaktionsmischung für 30 min bei RT die Mischung auf HEK-293-Zellen in der Kulturschale.</li>
	<li>Ermöglichen Sie nach der Transfektion die Transfectants wachsen und express Puromycin-Widerstand Genprodukte unter nicht-selektiven Kulturmedium (ohne Puromycin) für 24-48 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen das Kulturmedium die Transfectants mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.</li>
	<li>Wieder aussetzen der Transfectants in 50 mL vorgewärmten Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 10 mL der Zellen in 90 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Kulturzellen bei 37 ° C bis 50-60 % Konfluenz vor der Puromycin-Behandlung (in der Regel dauert dies etwa 24-48 h).</li>
	<li>Pflegen Sie die Transfectants bei 37 ° C im Zellkulturmedium für 3-4 Wochen mit 3 µg/mL Puromycin ergänzt. Während der Auswahl ändern Sie das Zellkulturmedium mit Puromycin (3 µg/mL) alle 2-3 Tage um Selektionsdruck zu erhalten. Wenn die Zellen voll konfluierende werden, teilen Sie sie nach den Verfahren in Schritten 3.3 3.4, mit Puromycin-haltigen Kulturmedium. Die restlichen Zellen in das Kulturmedium zu verwerfen, wenn nicht benötigt. Hinweis: Puromycin Selektionsbedingungen müssen experimentell für bestimmte Zelltypen hergestellt werden. Wir haben 3 µg/mL von Puromycin in Zellkulturmedium verwendet; Dies war genug, um Zelltod in nicht-transfizierten HEK293 induzieren.</li>
	<li>Ernte der Zellen aus einzelnen Kolonien, mit einem Klon Zylinder, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Entsorgen Sie das Zellkulturmedium. Spülen Sie die Platte zweimal mit vorgewärmten (37 ° C) PBS, schwimmende Zellen zu entfernen.</li>
		<li>Mit sterilen Pinzette set Klonen Zylinder über den einzelnen Kolonien.</li>
		<li>Jeder Zylinder 0,2 mL 0,35 % Trypsin/EDTA hinzufügen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C für 1 min, bis die Zellen freistehende sind, und fügen Sie ein paar Tropfen Kulturmedium vorgewärmt (37 ° C) zu den Zylindern.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellen von jeder Zylinder auf individuelle Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 2 mL Kulturmedium und 1 µg/mL Puromycin in jede Vertiefung. Hinweis: Wenn die Zellen konfluierende werden, Skalieren Sie die Kultur. Clone(s) kann jetzt festgelegt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie individuelle Klone im Zellkulturmedium mit 1 µg/mL Puromycin ergänzt.</li>
	<li>Einzelne Kolonien durch die Prüfung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Teb Behandlung (Endkonzentration, 10 µM) für 24 h Test der Reaktionsfähigkeit der Klone, die Teb analysiert die Expression des Transgens mit Immunoblotting überprüft. Wählen Sie einen gewünschten Klon (oder Klonen). Pflegen Sie eine Teb behandelt und eine unbehandelte Probe in Kulturmedium für 12-48 h bei 37 ° C vor der Analyse der Induktion-Ebene des Transgens. Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, nach den Verfahren in Schritten 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.</li>
</ol>4. Abbau der Teb
<ol><li>Die Teb Reize indem Teb enthaltenden Zellkulturmedium mit Teb-freies Medium zu stillen. Hinweis: Es wird empfohlen, die Wachstumsmedien zu ersetzen, ohne ersten Seeding der Zellen auf eine neue Kulturschale. Verbleibende Teb scheint an der Plastikschale festhalten und eine starken Hintergrund-Expression des Transgens zu entlocken. Vor dem Seeding der Zellen auf eine neue Kultur-Platte, spülen Sie die geernteten Zellen mehrmals mit Kulturmedium oder PBS.<ol>
<li>Die Zellen von den Kultur-Speisen durch Trypsinization zu distanzieren. Spülen Sie nach verwerfen die Teb mit Nährmedium die Teb-stimulierten Zellen zweimal mit vorgewärmten PBS (37 ° C), fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/EDTA und 1 min bei 37 ° c inkubieren Nach dem abschrecken Trypsin/EDTA durch Zugabe von vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (10 mL, 37 ° C), Ernten Sie die Zellen mit einem Zelle Schaber, gefolgt durch Zentrifugieren in einem 15 mL konische Röhrchen bei 21.000 x g für 2 min bei 18-25 ° C.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 50 mL vorgewärmten Teb-freien Kulturmedium (37 ° C) und Transfer 5 mL der Zellen in drei 60 mm Frischzellen-Kultur Gerichte. Die Zellen bei 37 ° C für 24, 48 und 72 h bzw. Kultur.</li>
		<li>Ernte der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten und die Expression des Transgens mithilfe Immunoblotting zu messen. Hinweis: Unter diesen Versuchsbedingungen wurde die Expression des Transgens nicht nachweisbar etwa 3 Tage Post-Kultur der Zellen in der Teb-freies kulturelles Medium (Abbildung 3). Die Expression des Transgens kann durch Immunoblotting, gemäß Schritte 2.5.1 - 2.5.7 gemessen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Wir haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.

Der größte Nachteil der Verwendung eines binären Genschalter Ausdruck ist die Notwendigkeit, zwei separate Plasmide (Fahrer und Effektor) gleichzeitig in die Zielzelle zu liefern. Dies führt zu einer ungleichen Verteilung von Plasmiden und Ergebnis in einer inkonsistenten Antwort des Schalters auf der Induktoren1,2,3. Ein weiterer Nachteil der zwei-Vektor-System ist, dass ein Minimum von zwei Runden von Antibiotika Auswahl e...

Mehrere verschiedene Genschalter wurden für ihre Fähigkeit, präzise regulieren Transgene Expression in Zellkulturen und Tiermodellen, mit unterschiedlichem Erfolg1,2,3untersucht. Potenzielle gen Schaltanlagen sollten mehrere strenge Kriterien, einschließlich treffen: präzise gerichtete Expression des Transgens, Dosierung und zeitabhängig Reaktionsvermögens zu induzieren, vernachlässigbar Undichtigkeit des Promoters, Reversibilität des Transgens Aktivierung durch Entfernung der Induktor und Induktor Toxizität erträglich zu Zell-Linien und Labor Tiere1,2,3. Mehrere kleine Molekül Induktoren wurden ausgebeutet, einschließlich Tetracyclin4,5, Rapamycin6,7,8, Mifepriston9,10, und Ecdyson11,12,13,14. In der Regel diese Systeme erfordern mindestens zwei Plasmide mit zwei oder drei diskrete Ausdruck Einheiten, ein oder zwei davon zu komponieren ein regulatorisches Element (Induktor Plasmid), das bindet eine kleines Molekül-Induktor transkriptionelle Aktivität zu gewinnen; und ein weiteres Plasmid (Effektor Plasmid), enthält das Transgen unter der Kontrolle einer regulatorischen DNA-Region, die den Zugang von der Induktor-gebundenen regulatorisches Element ermöglicht. Der größte Nachteil des binären Systems ist, dass es die gleichzeitige Einführung der beiden Vektoren (Induktor und Effektor) in die Zielzelle erfordert. In Transienten Transgene Ausdruck Experimente produziert die gleichzeitige Transfektion von zwei Plasmide unweigerlich eine Population von Zellen, die einzeln mit dem Induktor oder der Effektor transfiziert oder Co ungleich transfiziert. Darüber hinaus erfordert das binäre System mindestens zwei Runden von Antibiotika Auswahl, stabilen Zelllinien zu etablieren, das ist zeitaufwändig und mühsam. So verbindet alle Komponenten für die Expression des Transgens erforderlich und Verordnung in einem einzigen Vektor wäre ideal, um den gleichzeitigen Ausdruck alle erforderlichen Elemente in einer einzelnen Zelle zu gewährleisten und ermöglichen für die Regulierung der Expression des Transgens durch die Behandlung mit kleinen Moleküls induzieren.
Um die Mängel der binären Genschalter zu überwinden, entwickelten wir vor kurzem eine singuläre Genschalter mit einem Drosophila Melanogaster EcR-basierte gen induzierbaren System15. Ecdyson vermittelt Genexpression, wenn es um die EcR/Ultraspiracle (USP)-Heterodimer, bindet die Bindung von der EKR auf DNA-regulatorischen Elementen3,11wiederum induziert. Der vertebrate Retinoid X-Rezeptor (RXR), ein Ortholog des Insekts USP, Rekruten EcR um eine aktive transcriptional Aktivator16bilden. So, für die gezielte Expression von Transgen in vertebrate Zellen oder Gewebe, die EcR und RXR Co ausgedrückt gleichzeitig muss vor stimuliert durch Ecdyson oder seine Agonisten. Da die endogene RXR Ebene, Padidam Et Aldie heterodimerisierenden Funktion des Schalters EcR-basierte gen beeinflusst werden kann. ersetzt die EcR DNA-Bindung und Aktivierung Domains mit heterologen GAL4 DNA-Bindung, Herpes-Simplex-Virus-Protein-vmw65 (VP16) Aktivierung Domänen miteinander verschmolzen, die EcR Liganden-bindende Domäne, die dann wurde reagiert nicht auf endogene RXR und bildeten ein Homodimer transkriptionelle Aktivität17zu gewinnen. Die EcR-basierte Genschalter wurde weiter verbessert, durch den Bau ein chimäres Protein bestehend aus minimal VP16 Aktivierungsdomäne, kombiniert mit GvEcR, die ein Homodimer gebildet und in der Zellflüssigkeit in Ermangelung Ecdyson Agonist, Teb16lokalisiert, 18. Durch die Bindung an Teb, verändert die GvEcR seiner subzelluläre Lokalisation aus dem Zytosol in den Zellkern zu erkennen, ein Hybrid-Promotor bestehend aus Zebrafisch E1b minimal Förderer mit einem zehn Tandem kombiniert wiederholt vorgelagerten Aktivierung Sequenzen (Drohnen) zu initiieren die Transkription der Ziel-gen16.
Zur Vereinfachung der bisher gemeldeten EcR-basierte Gens schaltet16,18, wir kombiniert die binäre Funktionen des Systems in einen einzigen Vektor, ausgestattet mit allen erforderlichen Elementen für anregende Transgene Ausdruck und dann bezeichnet die neu generierten Vektor, pEUI(+) (GenBank Zbl-Nummer: KP123436, Abbildung 1A)15. Der Effektor reagieren auf den GvEcR-Treiber (im folgenden Treiber) besteht aus zehn Tandem UAS neben einem E1b minimal Förderer, gefolgt von einer Site mit mehreren Klonen (MCS) wiederholt mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Erkennungssequenzen (Abbildung 1 b). Zusätzlich, um die Auswahl zu erleichtern transfizierten Zellen, einer SV40 Projektträger-gesteuerte Puromycin N-Acetyl-Transferase (PAC) Gen wurde zwischen den Fahrer und Effektor Regionen weiterhin stabilen Zelllinien (Abbildung 1) gelegt.
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die transiente und stabile Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+). Darüber hinaus bieten wir detaillierte Anweisungen für den erfolgreichen Einsatz von Teb als Agonist Ecdyson.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>The patent license was transferred to TransLab Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein&lt;br/&gt; Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Präzise Steuerung des Transgens Ausdruck ist in biologischen und klinischen Studien wünschenswert. Jedoch, da die binäre Funktion der derzeit eingesetzten Genschalter die Übertragung von zwei therapeutische Ausdruck Einheiten gleichzeitig in eine einzelne Zelle erforderlich ist, beschränkt sich die praktische Anwendung des Systems für die Gentherapie. Um die Transgen-Expressionssystem zu vereinfachen, haben wir einen Genschalter als pEUI(+) umfasst einen kompletten Satz von Transgen Ausdruck Module in einem einzigen Vektor generiert. Bestehend aus der GAL4 DNA-bindende Domäne und modifizierte EcR (GvEcR), eine minimale VP16 Aktivierungsdomäne verschmolzen mit einem GAL4 DNA-bindende Domäne sowie eine modifizierte Drosophila Ecdyson Rezeptor (EcR), ist die neu entwickelte einzigartige Genschalter hoch auf die Gabe von chemischen Induktor in einer Zeit-Dosis-abhängigen Weise reagieren. Der pEUI(+)-Vektor ist ein potenziell leistungsfähiges Werkzeug zur Verbesserung der Kontrolle des Transgens Ausdruck in der biologischen Forschung und prä-klinischen Studien. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Modulation eines transiente und stabile Transgen Ausdrucks mit pEUI(+) Vektor durch die Behandlung von Tebufenozide (Teb). Darüber hinaus geben wir wichtige Hinweise für die Verwendung von Teb als eine chemische Induktor.

Die GvEcR-basierte singuläre Genschalter ist in Figur 1Adargestellt. Der pEUI(+) Vektor wurde durch die Behandlung mit Teb für regulierte Transgene Ausdruck optimiert. Die Effektor-Region des pEUI(+) umfasst eine 10xUAS und ein E1b minimal Projektträger eine MCS mit EcoRI, PmlI NheI, BmtI, AfeI und AflII Anerkennung Beschränkungsenzymsites folgen. Ein SV40 poly(A) Signal wurde hinter der MCS (Abbildung 1 b) hinzugefügt. Ein ...

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An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ein Ecdyson Rezeptor-basierte singuläre Genschalter für bewusste Expression des Transgens mit Robustheit, Reversibilität und vernachlässigbar Undichtigkeit

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Aufrufe.  Chungnam National University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation des Transgens Ausdruck mit pEUI(+) singular Genschalter durch Tebufenozide Behandlung.

Serie: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Forschung

Genetik

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Entwicklungsbiologie

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Immunologie und Infektion

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Zuverlässige Entwicklung und Kontrolle stabiler optogenetischer Genschaltkreise in Säugetierzellen

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Biotechnik

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Biologie

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www.jove.com/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

Induzierbares Tet-Off-regulierbares System: Eine In-vitro-Methode zur Modulation der Genexpression in kultivierten Zellen mit dem Tetracyclin-Off-System

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...