Name: an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

Yazarlar S-İ Choi (Chonnam National University) değerli yorum ve bizim el yazması ayrıntılı okuma için teşekkür ederiz. Bu eser Chungnam Ulusal Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Transgene Subcloning
<ol><li>Bir uygun restriksiyon enzimi tanıma sitesi (veya site) pEUI(+) MCS içinde seçin ve istenilen yönde (şekil 1) faiz gene subclone. Not: EGFP veya bayrak epitope öğesini ankyrin tekrar etki alanı 13A (ANKRD13A) transgene T4 DNA polimeraz bir sıra ve ligasyonu yöntem19klonlama bağımsız olarak kullanarak pEUI(+) vektör EcoRI sitedeki subcloned.</li>
	<li>37 ° C'de 1 h için EcoRI ile pEUI(+) linearize Mix 50 ng/µL olan pEUI(+) ile 40 ng/µL PCR güçlendirilmiş EGFP veya ANKRD13A, doğrusallaştırılmış ve T4 DNA polimeraz (1 U) önce 10 dakika süreyle buzda kuluçka (RT) oda sıcaklığında 1 dk ile reaksiyon karışıma doğrudan 100 µL eklemek 10 µL tepki DH10B yetkili hücreleri aşağıdaki dönüştürme için denemeler yapın. Not: her ne kadar birkaç restriksiyon enzimi tanıma sitesi pEUI(+) (şekil 1B) MCS eklenmiş, hedef gen EcoRI siteye subcloning tüp ligasyonu bağımsız klonlama teknolojisi19,20kullanmanızı öneririz.</li>
	<li>Sıralama tarafından INSERT doğrulayın ve sonra transfection için uygun olan bir DNA arıtma kit kullanarak DNA arındırmak.</li>
</ol>2. geçici Transfection ve Teb tedavi
<ol><li>% 5-10 fetal sığır serum (FBS) ve antibiyotik (100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin) ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) 5 mL taze pasajlı HEK293 hücreleri içeren dört hücre kültür yemekleri (60 mm çapında) hazırlamak. Bundan sonra "hücre kültür orta" veya sadece "kültür orta" FBS ve antibiyotik ile DMEM temsil eder. 37 ° C'de HEK293 hücreleri korumak</li>
	<li>1 µg saf DNA'ın % 50-60 yoğunluk transfection reaktif 3 µL kullanarak, HEK293 hücre içine transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 200 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin. Transfection için iki tabak kullanın ve diğer denetimleri tedavi edilmezse bırakayım.</li>
	<li>Transfection 12-24 saat sonra Teb (son konsantrasyonları, 0.2 - 10 µmol) birine transfected örnekleri ve sigara transfected denetimleri ekleyin. Diğer iki örnek deneysel kontrolleri tedavi edilmezse bırakın. Not: Teb hisse senedi çözüm (50 mM Dimetil sülfoksit içinde çözünmüş) hücre kültür orta, DMEM veya fosfat tamponlu tuz (PBS) deneysel parametrelere bağlı olarak kültürlü hücrelere eklemeden önce uygun bir konsantrasyon, seyreltilmiş. Ancak, sulu çözelti içinde Teb düşük çözünürlük nedeniyle, orta TEB'in yüksek bir konsantrasyon ile ana bir karışım hazırlama kaçının; Bunun yerine, taze orta Teb istenen konsantrasyon içeren tam hücre kültür orta yerine.</li>
	<li>Teb-tedavi ve tedavi edilmezse hücreler için 12-48 h 37 ° C'de yetiştirmek</li>
	<li>EGFP kullanarak eklerseniz, EGFP ifade floresan mikroskop ( Şekil 2) altında analiz. Aksi halde, bir immunoblotting tahlil için hücreleri hasat.<ol>
<li>İmmunoblotting tahlil için buz gibi PBS iki kez hücrelerle durulama ve sonra onları bir hücre kazıyıcı kullanılarak kazımak.</li>
		<li>Hücreleri kazık için spin hasat 21.000 x g (RT) 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde aşağı.</li>
		<li>PBS tamamen discarding sonra buz gibi memeli protein ayıklama reaktif 0.5 mL ekleyin (M-başı), proteaz inhibitörü (100 proteaz inhibitörü kokteyl x 5 µL), 60 mm tabak içinde hücreler kültürlü Eğer Pelet için ile birlikte.</li>
		<li>Pipetting birkaç tur hücrelerle yeniden askıya alma ve askıya alınan hücreler (RT) 18-25 ° C'de 15 dakika için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücre lysate 21.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de spin</li>
		<li>Sulu süpernatant temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın.</li>
		<li>İmmunoblotting, aşağıdaki standart iletişim kuralları ile uygun antikorlar tarafından süpernatant analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. nesil istikrarlı HEK293 hücre hatları ile pEUI(+) Gene Switch genomik entegrasyonu
<ol><li>5-10 µg transgene ile saf pEUI(+), 15-30 µL transfection reaktif kullanarak % 50-60 birleşmesi bir 90 mm çapında hücre kültür çanak içinde olan HEK293 hücrelere transfect. Seyreltici (DMEM FBS ve antibiyotikler olmadan) 500 µL transfection reaktif eklemek DNA içeren. 30 dk RT az reaksiyon karışımı kuluçka sonra kültür çanak HEK-293 hücrelerine karışımı ekleyin.</li>
	<li>Transfection sonra büyümeye ve puromisindir-direnç gen ürünleri için 24-48 h 37 ° C'de (puromisindir) olmadan seçici olmayan kültür orta altında hızlı transfectants izin ver</li>
	<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür orta atarak sonra transfectants Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile durulayın, 1 mL % 0.25 tripsin/ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Tripsin/EDTA sonra Şoklama Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek, hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
	<li>Transfectants 50 ml Önceden ısıtılmış kültür orta (37 ° C) ve transfer 10 mL hücrelerin içine 90 mm taze hücre kültür yemekler yeniden askıya alma. % 50-60 confluency puromisindir tedavi öncesi kadar 37 ° C'de hücreler kültür (genel olarak, bu yaklaşık 24-48 h alır).</li>
	<li>Hücre kültür 3 µg/mL puromisindir ile 3-4 hafta boyunca takıma orta 37 ° C'de transfectants yetiştirmek. Seçim döneminde seçimi basınç korumak için 2-3 günde puromisindir (3 µg/mL) içeren hücre kültür orta değiştirin. Hücreleri tamamen Konfluent olduğunda, puromisindir içeren kültür orta ile 3.3-3.4, adımda prosedürleri aşağıdaki bölüp. Kalan hücreleri kültür ortamında gerekli değildir Eğer atmak. Not: Puromisindir seçimi koşullar deneysel olarak belirli hücre tipleri için oluşturulmuş olmalıdır. Hücre kültürü ortamında 3 µg/mL puromisindir kullanılan; Bu hücre ölümü içinde sigara transfected HEK293 ikna etmek için yeterliydi.</li>
	<li>Hücre klonlama bir silindir kullanarak bireysel kolonilerden hasat ve üreticinin yönergeleri izleyin.<ol>
<li>Hücre kültür orta atın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) yüzen hücreleri kaldırmak için PBS ile plaka durulayın.</li>
		<li>Steril forseps kullanarak, klonlama silindir üzerinde bireysel kolonileri ayarlayın.</li>
		<li>%0.35 tripsin/EDTA 0.2 mL her silindir için ekleyin.</li>
		<li>Kadar hücreleri müstakil ve silindir için Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının birkaç damla eklemek için 1 dk 37 ° C'de çanak kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri her silindir 6-şey plaka bireysel wells kültür orta 2 mL ve 1 µg/mL puromisindir her iyi ile aktarın. Not: hücreleri Konfluent olduğunda, kültürünü büyütmek. Şimdi clone(s) gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre kültürü 1 µg/mL ile puromisindir takıma orta bireysel klonlar korumak.</li>
	<li>Bireysel kolonileri transgene ile immunoblotting ifade düzeyini analiz ederek onların duyarlılık için Teb tedaviye (son konsantrasyonu, 10 µM) 24 h Test yanıt için Teb klonların sınayarak doğrulayın. İstenen bir klonu (veya klonları) seçin. Teb tedavi ve tedavi edilmezse bir örnek 12-48 h 37 ° C'de için kültür ortamında transgene indüksiyon düzeyini analiz daha önce yetiştirmek. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 yordamlarda takip yoluyla ölçülebilir.</li>
</ol>4. Teb tükenmesi
<ol><li>Teb uyaranlara Teb-Alerjik orta ile Teb içeren hücre kültür orta değiştirerek gidermek. Not: Bu ilk hücreleri yeni bir kültür tabak üzerine reseeding olmadan büyüme ortamı değiştirin önerilir. Artık Teb plastik yemek için tutunacak görünür ve transgene güçlü arka plan ifadesidir temin. Hücreleri yeni bir kültür plaka üzerinde reseeding daha önce birkaç kez ile Kültür orta veya PBS hasat hücreleri durulayın.<ol>
<li>Kültür yemekleri hücrelerden trypsinization tarafından ayırmak. Kültür ortamı içeren Teb atarak sonra iki kez Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) ile Teb teşvik hücreleri durulama, 1 mL % 0.25 tripsin/EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1 dk. için kuluçkaya Teb-Alerjik Önceden ısıtılmış kültür orta (10 mL, 37 ° C) ekleyerek tripsin/EDTA Şoklama sonra hasat Santrifüjü 21.000 x g için 18-25 ° C'de 2 dk de 15 mL konik tüp içinde ardından bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri</li>
		<li>Önceden ısıtılmış Teb-Alerjik kültür orta (37 ° C) ve transfer 5 mL hücrelerin içine üç 60 mm taze hücre kültür yemekler 50 mL hücrelerde yeniden askıya alma. Sırasıyla 24, 48 ve 72 s 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
		<li>Hücreleri farklı zaman noktalarda hasat ve immunoblotting kullanarak transgene ifade düzeyini ölçmek. Not: Bu deneysel koşullarda belirlenemeyen yaklaşık 3 gün sonrası kültür Teb-Alerjik kültürel orta (şekil 3) hücrelerinin transgene ifade oldu. Transgene ifade düzeyini immunoblotting, adımları 2.5.1 - 2.5.7 göre tarafından ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossi, F. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+inducible+gene+expression+systems.">Recent advances in inducible gene expression systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 9 (5), 451-456 (1998).</li><li>Clackson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+gene+expression+systems.">Regulated gene expression systems.</a> Gene Ther. 7 (2), 120-125 (2000).</li><li>Suzuki, Y., Suzuki, Y., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatable+lentiviral+system.">Gene regulatable lentiviral system.</a> Viral Gene Therapy. , 285-309 (2011).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li><li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells:+principles+and+advances.">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Methods Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li><li>Hentges, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP/mTOR+is+required+for+proliferation+and+patterning+during+embryonic+development+in+the+mouse.">FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 13796-13801 (2001).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Seto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+and+mTOR:+a+serendipitous+discovery+and+implications+for+breast+cancer.">Rapamycin and mTOR: a serendipitous discovery and implications for breast cancer.</a> Clin Transl Med. 1 (1), 29 (2012).</li><li>Ulmann, A., Peyron, R., Silvestre, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+mifepristone+(MFP).">Clinical uses of mifepristone (MFP).</a> Ann N Y Acad Sci. 761, 248-260 (1995).</li><li>Sitruk-Ware, R., Spitz, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+mifepristone:+toxicology+and+safety+in+animal+and+human+studies.">Pharmacological properties of mifepristone: toxicology and safety in animal and human studies.</a> Contraception. 68 (6), 409-420 (2003).</li><li>Yao, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ecdysone+receptor+is+the+product+of+EcR+and+ultraspiracle+genes.">Functional ecdysone receptor is the product of EcR and ultraspiracle genes.</a> Nature. 366 (6454), 476-479 (1993).</li><li>Riddiford, L. M., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptors+and+their+biological+actions.">Ecdysone receptors and their biological actions.</a> Vitam Horm. 60 (2000), 1-73 (2000).</li><li>Saez, E., Nelson, M. C., Eshelman, B., Banayo, E., Koder, A., Cho, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ligands+and+coligands+for+the+ecdysone-regulated+gene+switch.">Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (26), 14512-14517 (2000).</li><li>Karzenowski, D., Potter, D. W., Padidam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+control+of+transgene+expression+with+ecdysone+receptor:+gene+switches+with+high+sensitivity+robust+expression,+and+reduced+size.">Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity robust expression, and reduced size.</a> Biotechniques. 39 (2), 191-200 (2005).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone+receptor-based+singular+gene+switches+for+regulated+transgene+expression+in+cells+and+adult+rodent+tissues.">Ecdysone receptor-based singular gene switches for regulated transgene expression in cells and adult rodent tissues.</a> Mol. Ther. Nucleic Acids. 5 (9), e367 (2016).</li><li>Esengil, H., Chang, V., Mich, J. K., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+regulation+of+zebrafish+gene+expression.">Small-molecule regulation of zebrafish gene expression.</a> Nat Chem Biol. 3 (3), 154-155 (2007).</li><li>Padidam, M., Gore, M., Lu, D. L., Smirnova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-inducible,+ecdysone+receptor-based+gene+expression+system+for+plants.">Chemical-inducible, ecdysone receptor-based gene expression system for plants.</a> Transgenic Res. 12 (1), 101-109 (2003).</li><li>Knopf, F., Schnabel, K., Haase, C., Pfeifer, K., Anastassiadis, K., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetOn+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetOn systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Jeong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+sequence-+and+ligation-independent+cloning+as+a+rapid+and+versatile+cloning+method+for+functional+genomics+studies.">One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (15), 5440-5443 (2012).</li><li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion+assembly:+seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins,+modular+vectors,+and+mutations.">In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li><li>No, D., Yao, T. P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-inducible+gene+expression+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice.">Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (8), 3346-3351 (1996).</li><li>Sawada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+insecticidal+activity+of+benzoheterocyclic+analogues+of+N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide:+Part+1.+Design+of+benzoheterocyclic+analogues.">Synthesis and insecticidal activity of benzoheterocyclic analogues of N'-benzoyl-N-(tert-butyl)benzohydrazide: Part 1. Design of benzoheterocyclic analogues.</a> Pest Manag Sci. 59 (1), 25-35 (2003).</li><li>Lafont, R., Girault, J. P., Kerb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excretion+and+metabolism+of+injected+ecdysone+in+the+white+mouse.">Excretion and metabolism of injected ecdysone in the white mouse.</a> Biochem Pharmacol. 37 (6), 1174-1177 (1988).</li><li>Carlson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+and+biological+properties+of+methoxyfenozide,+a+new+insecticidal+ecdysteroid+agonist.">The chemical and biological properties of methoxyfenozide, a new insecticidal ecdysteroid agonist.</a> Pest Manag Sci. 57 (2), 115-119 (2001).</li><li>McConnell, M. J., Imperiale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+adenovirus+and+its+use+as+a+vector+for+gene+therapy.">Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 15 (11), 1022-1033 (2004).</li><li>Gorell, E., Nguyen, N., Lane, A., Siprashvili, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+skin+diseases.">Gene therapy for skin diseases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (4), a015149 (2014).</li><li>Kotterman, M. A., Chalberg, T. W., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Vectors+for+Gene+Therapy:+Translational+and+Clinical+Outlook.">Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook.</a> Annu Rev Biomed Eng. 17, 63-89 (2015).</li><li>Matsumoto, T., Yamaguchi, M., Kuzume, M., Matsumiya, A., Kumada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+gene+transfer+with+adenovirus+vector+via+the+spleen+safely+and+effectively+improves+posthepatectomized+conditions+in+diabetic+rats.">Insulin gene transfer with adenovirus vector via the spleen safely and effectively improves posthepatectomized conditions in diabetic rats.</a> J Surg Res. 110 (1), 228-234 (2003).</li><li>Han, J., McLane, B., Kim, E. H., Yoon, J. W., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remission+of+diabetes+by+insulin+gene+therapy+using+a+hepatocyte-specific+and+glucose-responsive+synthetic+promoter.">Remission of diabetes by insulin gene therapy using a hepatocyte-specific and glucose-responsive synthetic promoter.</a> Mol Ther. 19 (3), 470-478 (2011).</li></ol>

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Bir ikili gen ifade anahtarı kullanmanın en büyük dezavantajı aynı anda iki ayrı plazmid (sürücü ve efektör) hedef hücreye teslim etmek ihtiyacıdır. Bu eşitsiz dağılımı Plazmid ve tutarsız bir yanıt sonucu indükleyicileri1,2,3geçmek için yol açabilir. İki-vektör sisteminin başka bir eksiklik en az iki el antibiyotik seçimi taahhüdü hücre satırları tanımlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenl...

Tam olarak hücre kültürü ve hayvan modellerinde başarı1,2,3değişen derecelerde transgene ifade düzenlemek yeteneklerini için birkaç farklı gen anahtar incelemiş bulunuyoruz. Potansiyel gen anahtar sistemleri de dahil olmak üzere birkaç sıkı kriterleri karşılamak: hassas yönlü ifade transgene, dozaj ve zaman bağımlı kavramaları indükleyicileri, düzenleyicinin önemsiz leakiness, transgene reversibility etkinleştirme uyarıcı kaldırma ve uyarıcı toksisite düzeyleri hücre satırları ve laboratuvar hayvanları1,2,3için tolere edilebilir. Birkaç küçük molekül indükleyicileri, tetrasiklin4,5, rapamycin6,7,8, mifepristone9,10da dahil olmak üzere istismar, ve ecdysone11,12,13,14. Genel olarak, bu sistemler, iki ya da üç ayrı ifade birimleri içeren en az iki plazmid gerektirir, bir ya da iki tanesi transkripsiyon etkinlik kazanmak için bir küçük molekül uyarıcı bağlar bir düzenleyici öğesi (uyarıcı plazmid) oluşturmak; ve başka bir plazmid (efektör plazmid) uyarıcı bağlı yasal öğe erişim sağlar düzenleyici bir DNA bölge kontrol altında transgene içeren. En büyük dezavantajı ikili sistemdeki hedef hücre içine iki vektörlerin (uyarıcı ve efektör) giriş eşlik eden gerektirmesidir. Geçici transgene ifade denemelerinde iki plazmid aynı anda transfection kaçınılmaz bir nüfus tek başına uyarıcı ya da efektör ile transfected veya unequally co transfected hücre üretir. Ayrıca, ikili sistem istikrarlı hücre hatları, zaman alan ve zahmetli olan kurmak için antibiyotik seçimi en az iki tur gerektirir. Bu nedenle, tüm bileşenleri birleştirerek transgene ifade için gerekli ve yönetmelik tek bir vektör içine tek bir hücredeki tüm gerekli öğeleri eşlik eden ifade garanti ve transgene ifade Yönetmeliği için izin vermek ideal olacaktır Küçük molekül indükleyicileri ile tedavi yoluyla.
İkili gen anahtarları eksikliklerin üstesinden gelmek için biz son zamanlarda bir tekil gen anahtar, bir Drosophila melanogaster EcR tabanlı gen indüklenebilir sistem15kullanılarak geliştirilmiş. Sırayla DNA düzenleyici elemanlarının3,11EcR bağlama indükler EcR/ultraspiracle (USP) heterodimerdir için bağlandığında ecdysone gen ekspresyonu aracılık eder. Omurgalı retinoid X reseptör (RXR), böcek USP, bir ortholog bir etkin transkripsiyon aktivatör16oluşturmak için EcR acemi. Böylece, omurgalı hücreleri veya doku transgene hedeflenen ifadesi için EcR ve RXR aynı anda ecdysone veya onun agonistler tarafından daha önce uyarılmış ortak ifade olması gerekir. Heterodimeric özelliği EcR tabanlı gen anahtarının endojen RXR düzeyi, Padidam ve arktarafından etkilenmiş olabilir beri. EcR DNA'ya bağlanıcı ve harekete geçirmek etki alanları kapaklı GAL4 DNA'ya bağlanıcı ile herpes simpleks virüs protein vmw65 yerine (VP16) etkinleştirme etki alanları erimiş olan o zaman endojen RXR tepkisiz oldu ve bir homodimer oluşan EcR ligand bağlayıcı etki Transkripsiyon etkinliği17kazanmak için. EcR tabanlı gen anahtar en az VP16 harekete geçirmek etki alanı olan bir homodimer oluşmuş ve ecdysone agonist, Teb16yokluğunda sitozol lokalize GvEcR ile birlikte oluşan bir chimeric protein oluşturmak yoluyla daha da geliştirildi, 18. Teb için bağlama tarafından GvEcR onun hücre altı yerelleştirme sitozol en az organizatörü kombine ile on bir tandem Zebra balığı E1b oluşan bir karma organizatörü ters yönde harekete geçirmek dizileri (UASs) başlatmak için tekrar tanımak için çekirdek değişti Transkripsiyon hedef gene16.
Daha önce raporlanmış EcR tabanlı gen basitleştirmek için16,18geçer, uyarıcı transgene ifade için tüm gerekli öğeleri ile donatılmış ve daha sonra belirlenen bir tek vektör ikili sistemin özelliklerini kombine Yeni oluşturulan vektör pEUI(+) (GenBank üyelik numarası: KP123436, şekil 1A)15. GvEcR sürücü (bundan sonra sürücü) yanıt efektör on tandem birden çok klonlama sitesi (MCS) tarafından takip E1b en az organizatörü yanındaki UAS tekrarlar, EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII tanıma dizileri ile (şekil 1B) oluşur. Buna ek olarak, seçimi kolaylaştırmak için transfected hücreleri, bir SV40 organizatörü tahrik puromisindir N-asetil-transferaz (PAC) gen istikrarlı hücre satır (şekil 1) korumak için sürücü ve efektör bölgeler arasında yerleştirildi.
Biz transgene ifade pEUI(+) kullanarak geçici ve istikrarlı modülasyon için detaylı bir protokol tanımlamak. Buna ek olarak, bir ecdysone agonist TEB'in başarılı kullanımı için ayrıntılı yönergeler sağlar.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>The patent license was transferred to TransLab Inc.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gene-Fect Transfection Reagent</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>SPL life science</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>mouse FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin antibody</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cloning cylinder</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Mammalian Protein&lt;br/&gt; Extraction Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Protease inhibitor Cock. III</td><td>T&amp;amp;I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

an ecdysone receptor-based singular gene switch for deliberate expression of transgene with robustness, reversibility, and negligible leakiness

Hassas kontrol transgene ifade biyolojik ve klinik çalışmalarda tercih edilir. Ancak, şu anda istihdam gen anahtarları ikili özelliği iki tedavi edici ifade ünite transferi aynı anda tek bir hücreye gerektirdiğinden, gen tedavisi için sisteminin pratik uygulama sınırlıdır. Transgene ifade sistemi basitleştirmek için tek bir vektör transgene ifade modüllerde eksiksiz bir dizi kapsayan pEUI(+) olarak belirlenmiş bir gen anahtarı oluşturulur. GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanını oluşan ve değiştirilmiş EcR (GvEcR), en az bir VP16 harekete geçirmek etki GAL4 DNA'ya bağlanıcı etki alanı, hem de değiştirilmiş Drosophila ecdysone reseptör (EcR), ile erimiş yeni geliştirilen tekil gen anahtarı son derece olduğunu kimyasal bir uyarıcı bir saat ve doz bağımlı şekilde yönetimi için duyarlı. PEUI(+) vektör transgene ifade Biyolojik araştırma ve önceden klinik çalışmalar kontrolünü geliştirmek için potansiyel olarak güçlü bir araçtır. Burada, detaylı bir iletişim kuralı modülasyonu pEUI(+) vektör tebufenozide (Teb) tedavi ile kullanarak bir geçici ve istikrarlı transgene ifade için mevcut. Ayrıca, kimyasal bir uyarıcı olarak Teb kullanımı için önemli bir yönerge paylaşıyoruz.

Tekil gen GvEcR tabanlı anahtar şekil 1Aile tasvir edilir. PEUI(+) vektör Teb ile tedavi tarafından düzenlenmiş transgene ifade için optimize edildi. PEUI(+) efektör bölgesinin bir 10xUAS ve EcoRI, PmlI, NheI, BmtI, AfeI ve AflII restriksiyon enzimi tanıma siteleri içeren bir MCS tarafından en az organizatörü takip bir E1b oluşmaktadır. Bir SV40 Poli(a) sinyal MCS (şekil 1B) eklendi. PAC gen puromisindir...

Watch this Scientific Journal Video about An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness at JoVE.com

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

an-ecdysone-receptor-based-singular-gene-switch-for-deliberate

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Görüntüleme.  Chungnam National University. Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Video: An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Genetik

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based approaches. For example, although chimeric and Cre-LoxP targeting strategies have been widely used, the intrinsic limitations of these strategies (i.e., leaky promoter activity, mosaic Cre expression, etc.) have significantly restricted their application. Moreover, a complete deletion of many endogenous genes is embryonically lethal, making it impossible to study gene function in postnatal life. To address these challenges, we have made significant changes to an early genetic engineering protocol and combined a short (transgenic) version of the Rb1 gene with a lysosomal protease procathepsin B (CB), to generate a DN mouse model of Rb1 (CBRb). Due to the presence of a lysosomal protease, the entire CB-RB1 fusion protein and its interacting complex are routed for proteasome-mediated degradation. Moreover, the presence of a tetracycline inducer (rtTA) element in the transgenic construct enables an inducible and reversible regulation of the RB1 protein. The presence of a ubiquitous ROSA-CAG promoter in the CBRb mouse model makes it a useful tool to carry out transient and reversible Rb1 gene ablation and provide researchers a resource for understanding its activity in virtually any cell type where RB1 is expressed.

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Here we present a protocol to develop a dominant-negative inducible system, in which any protein can be conditionally inactivated by reversibly overexpressing a dominant-negative mutant version of it.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for reversible and tunable expression control of an endogenous gene of interest in living model systems. The REMOTE-control system employs enhanced lac repression and tet activation systems to achieve down- or upregulation of a target gene within a single biological system. Tight repression can be achieved from repressor binding sites flexibly located far downstream of a transcription start site by inhibiting transcription elongation. Robust upregulation can be attained by enhancing the transcription of an endogenous gene by targeting tet transcriptional activators to the cognate promoter. This reversible and tunable expression control can be applied and withdrawn repeatedly in organisms. The potency and versatility of the system, as demonstrated for endogenous Dnmt1 here, will allow more precise in vivo functional analyses by enabling investigation of gene function at various expression levels and by testing the reversibility of a phenotype.

This protocol outlines the steps needed to generate a model system in which the transcription of an endogenous gene of interest can be conditionally controlled in live animals or cells using enhanced lac repressor and/or tet activator systems.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Gelişim Biyolojisi

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Biyomühendislik

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Biyoloji

Inducible Tet-Off Regulatable System: An In Vitro Method to Modulate Gene Expression in Cultured Cells Using Tetracycline-Off System

Source: Migneault, F. et al, <a href="https://www.jove.com/v/60654">Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the method of regulating gene expression in cultured cells by transfection with a plasmid containing a gene of interest and a regulatory plasmid. The expression of this plasmid can be controlled by tetracycline or its synthetic analogs, making this system a useful model to study regulatable gene expression.

İndüklenebilir Tet-Off Düzenlenebilir Sistemi: Tetrasiklin Kapalı Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Gen Ekspresyonunu Modüle Etmek İçin Bir İn Vitro Yöntem

Source: Migneault, F. et al, Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in ...