この作品は費補助金科学研究 (15 K 07147、17 K 07419) 日本学術振興会から (洋石本、佐野寛子) (HI) に稲盛財団研究助成金、共同利用・共同研究センターのプログラムでサポートされる発生発達医学分子発生学・遺伝学 (HS) に熊本大学研究所。イメージング システムを使用して彼らの助け、上川内あづさ先生と山田大地さんに感謝します。

1. 幼虫の脳外植片の準備
<ol><li>イメージング室を作る。 注: 脳外植片が係留される安定した記録が必要です。ここでは、低コスト、手作りのイメージング商工会議所は、Ca2 +イメージング システムで使用されます。<ol>
<li>鉗子を使用して、取り付け簡単 (手順 1.3,図 1) を作る幼虫の脳の腹側神経節の凹みを作成するプラスチック製培養皿 (35 mm × 10 mm) の底面の中心を傷つけます。</li>
		<li>、つまようじでくぼみの両側に瞬間接着剤の小さなドロップを配置し、タングステン棒 (径 0.125 mm、6 〜 7 mm 長さ) を接着剤に添付します。</li>
		<li>パテのような再利用可能な接着剤の小さなピースを使用して、作る円形の壁 (10 mm 径、高さ 3 mm) 周囲の凹み (図 1)。 注: 壁の内側の空間が後で満ちるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 0.14 M NaCl、0.0027 M KCl、0.01 M PO43 -、pH 7.4 ± 0.05 25 ° C で)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物の準備 注: カルシウム イメージング、カルシウム インジケーター、GCaMP6s は組織特異 GAL4 とUA GCaMP6sの組み合わせを使用して実現されます一般的興味のセル型で表されます。信号が候補受容体を通して仲介されることを確保するため、GCaMP6s も変異受容体の欠陥で表されます。<ol>
<li>野生型と変異体など異なる遺伝子型の実験的比較が必要な場合、GCaMP6 式レベル変動と生理学的な発達段階の違いを避けるために一致テスト幼虫を年齢します。</li>
		<li>食品の表面に産卵を許可する 8 h の標準的なはえの食糧を含む文化バイアルに親のハエ (各性のため 30 ハエ) をしてください。質量 25 ° C と 60-70% の相対湿度で 12 時間の明暗周期下における幼虫の文化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幼虫の脳の解剖<ol>
<li>90-120 h 産卵 (AEL) 後、幼虫を収集し、付着性の食べ物のかすを除去する蒸留水で少なくとも 3 回洗ってください。</li>
		<li>場所 1.5 インチ正方形時計ガラスの幼虫は、氷冷 PBS でいっぱい。 注: 次の 2 つの手順この時計ガラスの解剖顕微鏡下で実行されます。</li>
		<li>幼虫の中央部を優しくつかむ鉗子を使用します。口フックを取得し、別の体の残りの部分から脳を含む幼虫の前方の部分に優しく口フックを引くもう一つの鉗子を使用します。 注: また、外科はさみ使用できます。</li>
		<li>鉗子で前方の先端を押し、幼虫を裏返しします。成虫ディスク、脂肪体、リング腺など、脳に付着した余分な組織を削除します。口器から脳を優しきます。</li>
		<li>200 μ L の PBS をイメージングの商工会議所のパテのような再利用可能な接着剤は、リングの内側に適用されます。パスツール ピペットに PBS で切り裂かれた脳を優しく吸うし、部屋に転送。</li>
	</ol>
</li>
	<li>部屋に脳を設定<ol>
<li>鉗子を使用して、腹側の神経節から伸びる筋線維をつかみます。タングステン線の下に凹みに脳をゆっくり挿入します。</li>
		<li>プル タングステン線は別鉗子を使用すると、(図 1) をイメージングのため適切な位置に脳にもわずかに配置しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 +蛍光画像の取得
注: 脳外植片 PBS 中に浸漬、水浸対物レンズ × 20 を搭載した蛍光顕微鏡を使ってイメージ化 (n. a. = 0.5)。PBS は、脳細胞をアクティブにしません。Z 軸のイメージが必要な場合圧電アクティブ レンズ発動機を対物レンズを搭載します。回転のディスク共焦点ヘッドは、時間分解能を高めるために使用されます。低光イメージングのため電荷結合素子カメラを掛けて電子顕微鏡がマウントされます。GCaMP6s 蛍光イメージング (励起/蛍光: 488/509 nm) 励起発光フィルターとダイクロイック ビーム ・ スプリッターの 488 nm レーザーが必要です (e.g。, 528 ± 38 nm 帯域バンドパス フィルター)。
<ol><li>顕微鏡下で脳外植体を含むイメージングのチャンバーを配置します。</li>
	<li>それが PBS に触れるまでは、対物レンズを下げます。明視野照明下における脳の位置し、焦点に持って来る。蛍光灯に切り替えて、GCaMP6s というラベルの付いたセルにフォーカスを調整します。 注: GCaMP6s の基部の緑の蛍光性が見えるはずです。</li>
	<li>250 ms で集録を開始/水冷モードで適正な取得ソフトウェアを使用して 512 × 512 ピクセルの解像度でフレーム (e.g。、µManager)。16 ビット画像 (ダイナミック レンジ 0 65,535) と CCD カメラのダイナミック レンジ内の蛍光値を取得がない 1000 (任意の単位) より低い露出時間を調整します。 注: GCaMP6s の光退色を最小限に抑える低露光時間を使用ください。露光時間を最適化して、GCaMP6 の発現と検出システムの感度にかかっており各実験でください。それは私たちを用いた実験で 100 ms dilp2 > GCaMP6s です。Z セクションが指定した深さでイメージングに必要ないくつかの z 断面画像は露出時間とフレームの間隔によって取得できます。カメラに十分な空間分解能がある場合は、露出時間を短縮するビニング サイズ (1 つデジタル ピクセルにビンがオンチップ レジスタの数) を増やしてください。</li>
	<li>撮像パラメーターが決まったら、基準信号強度 (F0) を検出するペプチド投与前に、1 分の画像を取る。</li>
	<li>テスト ペプチドを適用します。このため、PBS におけるペプチド溶液 100 μ L を溶解し、最適濃度をもたらす幼虫お風呂に直接ピペットします。 注: ペプチド ソリューションゆっくり注入する必要があります (例えば流率 20 μ L/s) にピペットを使用してバス ソリューション。PBS に溶解した無関係の合成ペプチドは、ネガティブ コントロールとして使用されます。</li>
	<li>数分の GCaMP6s 排出量を記録します。</li>
</ol>3. データ分析
注: 画像データは、ImageJ とオフライン分析されます。時間経過イメージ投射の間を移動する幼虫の脳を引き起こすピペッティングします。したがって、解析の前にシリアルの画像の位置異常を修正必要があります。補正は、ImageJ、プラグイン、TurboReg を次のように使用して実行できます。
<ol><li>解析ソフトウェアを開き、参照イメージとして (ペプチッドのアプリケーション) の前に最初のフレームを使用します。</li>
	<li>プラグインを選択 |登録 |TurboReg。</li>
	<li>ソースとしてシリアル イメージ ファイルとターゲットとして参照イメージを選択します。</li>
	<li>それぞれ剛体(平行変位と画像の回転) と正確性(「高速」は代わりに高速な解析粗いです) を処理方法と品質を確認します。</li>
	<li>バッチ画像処理を開始するをクリックします。</li>
	<li>分析を用いた関心 (ROIs) の複数の領域を選択 |ツール |ROI マネージャー ImageJ で。</li>
	<li>もっとをクリックしてピクセル強度を測定 |マルチ メジャー |OK ROI マネージャー] ウィンドウで。</li>
	<li>計算 ΔF/F0 = (F - F0)/F0、どこ F ROI 強度刺激時と F0は特定の実験的イベントの直前の時間帯での強度 (例えば30 前のフレーム、刺激開始)。</li>
	<li>複数の脳サンプルを使用して、平均と各時点での平均 (SEM) の標準エラーを取得する統計処理を行う実験を繰り返します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morton, G. J., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+central+nervous+system+control+of+glucose+metabolism.">Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism.</a> Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).</li><li>Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+regulation+of+food+intake.">Hormonal regulation of food intake.</a> Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).</li><li>Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae.">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).</li><li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits.">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li><li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation.">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li><li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity.">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

Ca2 +イメージング法は、ここで説明した脳のホルモンの機能をテストするための便利なシステムです。生体内で、脳は様々 な内分泌腺からホルモンを受け取ります。さらに、脳は常に自発神経活性化を引き起こす感覚情報を昇順を認識します。この前のヴィヴォシステムは、このようなノイズを排除し、生体内イメージングより良い信号/ノイズ比が得られます。?...

臓器器官のコミュニケーションは、環境の変化に対処するための恒常性を維持するための進化上保存された戦略です。人間、内分泌腺からホルモン直火のさまざまな循環に。これらのホルモンの多くは代謝過程と1,2を供給など基本的な動作を調節する脳の視床下部をターゲットします。多くのホルモンは、哺乳類のモデルを使用して発見されています。しかし、彼らの行動は、彼らが参加、特に interorgan ネットワークのメカニズムはほとんど不明します。
キイロショウジョウバエは、臓器器官のコミュニケーションを研究するための有用なモデルとして登場しました。昆虫では、多くの生理学的なプロセスはホルモンによって制御されます。成長と変容に着目した初期の研究では、大型の昆虫を使用しました。これらの研究で削除または特定の臓器の移植は、臓器間のシグナリング分子の存在を予言その後、幼若ホルモン (JH)、Prothoracicotropic ホルモン (PTTH) とエクダイソン生化学的精製3,4,5をだった。細胞内情報伝達の大家族は、昆虫のライフ サイクル6、7の中に様々 な生理学的なイベントに関与すると考えられます。これらのペプチドのほとんどは、特定の Gpcr が従来のアプローチを使用して識別するために最初に困難な G タンパク質共役受容体 (Gpcr) に関する法律します。ショウジョウバエゲノム シーケンス8の出版物は、他の昆虫に見られる彼らの相同性に基づくショウジョウバエ生理活性ペプチドの同定に有効な画期的なだった。さらに、いくつかのペプチド受容体は、Gpcr 細胞・培養技術を用いた GPCR リガンド結合アッセイを使用してゲノムの予測から同定された.次に、発現解析は、これらのペプチド受容体によって誘発される臓器に経路を予測しました。特に、推定ペプチド受容体の多くは脳で脳はペプチド ホルモン9の主要なターゲットであることを示唆するいると表現されます。また、ショウジョウバエで高度な遺伝学的ツールは、ペプチド GPCR の組み合わせの生理的な役割の同定に貢献しました。例えば、GAL4 と LexA ベースのバイナリ転写システム時空間制御された方法では遺伝子ノックダウンまたは過剰発現を有効。 にします。酵母で識別される転写因子 GAL4 を上流活性化シーケンス (UAS) と呼ばれる特定のシス配列にバインドします。GAL4/UAS システム ドライバー ライン提供組織固有または段階における発現 GAL4 とレスポンダー ライン ドライブ shRNA 発現する構造や興味の遺伝子の上流の UAS を運ぶ。LexA/LexAop システムは、同様のメカニズムに基づいています。組織特異ペプチド ノックダウンおよび組織固有の GPCR ノックダウン動物の表現型解析は、ペプチド GPCR シグナル モードおよびアクションのサイトに関する情報を表示できます。ただし、遺伝的データによってだけ達することができる結論は制限されます。その一方で、特定のペプチド ホルモンの推定の対象は、組織または細胞の種類に絞られて、一度ペプチド GPCR シグナリングを介した臓器にコミュニケーションを明らかにする前のヴィヴォカルシウム器官外植体のイメージングを使用できます。Gq 共役 GPCR の活性化、ER10からの Ca2 +の放出による細胞内 Ca2 +濃度が増加します。脳神経の活性化はまた細胞内 Ca2 +濃度を高めます。このような Ca2 +増加はカルシウム センサー GCaMP は、Ca2 +蛍光発光11の結果の存在下での構造変化を経るによって検出できます。
この記事では、カルシウム イメージングを用いたショウジョウバエの脳外植片を説明します。特定のニューロンを作動するペプチドの機能をテストするテスト ペプチドは GCaMP 表現脳植に適用され、共焦点顕微鏡による蛍光の変化を監視します。GPCR が関与し、GPCR に欠けている突然変異体の脳を使用して同じアッセイを行って確認します。イメージングと遺伝学の組み合わせは、ペプチドによる臓器器官のコミュニケーションに関する正確な情報を提供しています-Gpcr。 可能な変更およびこのプロトコルのアプリケーションについても説明します。

<table><tbody><tr><td>Tungsten rod</td><td>A-M systems, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>putty-like reusable adhesives</td></tr><tr><td>Watch glass, square, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Phosphated buffered salts</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>Custum-synthesized peptide</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>water-immersion objective lens</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC objective scanner with long travel range</td><td>Physik Instrumente GmbH &amp;amp; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>piezoelectric-activated lens mover</td></tr><tr><td>Confocal Scanner Unit CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>spinning disc confocal head</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD camera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroic beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/38-25</td><td>emission filter</td></tr><tr><td>&amp;micro;Manager</td><td>Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&amp;eacute;venaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila

内分泌シグナルによる臓器に通信たとえば、脳に周囲からは恒常性を維持するために不可欠。内分泌研究のためのモデルとして、キイロショウジョウバエ、遺伝学的ツールとゲノム情報が洗練された、これがますます使用されています。この資料では、ショウジョウバエ脳外植体のカルシウム イメージング法について説明します。このメソッドは、脳にホルモンの直接シグナルを検出できます。多くのペプチッド ホルモン行動を通じて G タンパク質共役受容体 (Gpcr) が活性化は、細胞内 Ca2 +濃度の増加を引き起こすことが知られています。神経活性化は、細胞内の Ca2 +濃度 Ca2 +流入の Ca2 +細胞質網状質 (ER) に格納されているリリースからも高めます。カルシウム センサー、GCaMP は、これらの Ca2 +変更を監視できます。この方法で GCaMP は関心のニューロンで表現され GCaMP 表現する幼虫の脳は解剖、養殖前のヴィヴォ。テストのペプチドが脳植に適用されますし CCD カメラを装備して回転ディスク共焦点顕微鏡を用いた GCaMP の蛍光変化を検出する.このメソッドを使用すると、任意の水溶性分子をテストことができますと適切な蛍光インジケーターを使用して神経の活性化に関連付けられている様々 な携帯電話イベントをイメージすることができます。また、他のショウジョウバエや他の動物の臓器を画像に、イメージングのチャンバーを変更すると、このメソッドを使用できます。

このプロトコルを使用すると、ペプチド ホルモン、CCHa2、インスリン産生細胞脳 (IPCs) の活性化を調べた。GCaMP6s とラベル付けされた野生型脳の IPCs dilp2 -GAL412 (ルイグソン博士からの贈り物) とUA GCaMP6s13 (キム博士からの贈り物) の組み合わせを使用します。合成 CCHa2 ペプチドと扱われた幼虫の脳外植体と GCaMP6s からの?...

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Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

9.1K ビュー.  Nagoya University. 本稿では、ショウジョウバエの脳のカルシウム イメージング前のヴィヴォのプロトコルについて説明します。この方法で天然または合成化合物は、脳の特定の神経細胞をアクティブにする能力をテストするバッファーに適用できます。

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

発生生物学

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

神経科学

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

の生理反応を測定します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

免疫・感染学

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

カルシウムイメージングによる ショウジョウバエ のてんかん様イベントのモニタリング

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

著者スポットライト:てんかん研究の最近の進歩の技術と調査結果への洞察 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

ショウジョウバエ In Vivoカルシウムイメージング:神経活動の機能イメージング法

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
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Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウムイメージング

要約

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内イメージングカルシウム

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

の生理反応を測定します

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

ショウジョウバエ In Vivoカルシウムイメージング:神経活動の機能イメージング法

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

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内イメージングカルシウム

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

の生理反応を測定します

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける学習誘発シナプス可塑性の生体内光学カルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

ショウジョウバエ In Vivoカルシウムイメージング:神経活動の機能イメージング法

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング

Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウジョウバエモデルに対するカルシウムイメージング