我々は、この原稿の準備中に支援するためのローラ・バンプトン、アレックス・デビッドソン、リチャード・パートン、有田Acharyaさんに感謝しています。卵活性化の議論のためのマリアナWolfner。イメージングのサポートのためのマット・ウェイランド。実験室での一般的なサポートのためのナン胡。 この作品は、TTWにケンブリッジ、ISSFの大学[認可番号097814]によってサポートされていました。

注：特に明記しない限り、室温ですべてのステップを実行します。 1.解剖の準備注：ここで説明する手順は、E Gavis、プリンストン大学＆ワイルらに従っています。アル。18。 2日間の撮影前に、次の手順を実行します。 <ol><li>固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り、1コーナーに乾燥酵母の少量を追加し、1g未満で十分です。 注：フライバイアルまたは食品に関する情報は、「 ショウジョウバエのメンテナンス」19を参照してください。 </li><li>酵母を水和するために3滴の水 - 1を追加します。 </li><li> 45°の角度で脇バイアルを設定し、3許可 - 水を取るために酵母のための5分。 </li><li>酵母は水を吸収している間に、最近（myristoyを浮上している浴槽-VP16GAL4（GCaMP5と呼ばれる）によって駆動UASt- マイア GCaMP5 20を発現しているハエのボトルを選択GCaMP5のされた関連の形）が卵に膜にGECIをテザリングを介して、高い信号対雑音比を提供するために選ばれました。 </li><li> CO 2ガスを瓶の中にハエをAnaesthetize。ウェットフードでハエを失わないように、倒立ボトルを保つようにしてください。 </li><li> CO 2パッドの上に麻酔ハエヒントとソート10から15人の女性と解剖顕微鏡下で絵筆を使用して5人の男性。注：解剖のための健康的なメスを提供するために、男性を含めるための規格です。 </li><li>ステップ1.3からのバイアルの準備ができたら、バイアルに選択されたハエを追加します。ハエがアクティブになるまでバイアル水平を保つように注意してください。 </li><li>約36時間、25℃でバイアルを置きます。 </li><li>ボトルや廃棄にCO 2パッドから残りのハエを返します。 </li></ol> 2.解剖ショウジョウバエ卵巣注：ここで説明する手順は、ワイルらに従っています。アル。 <s&gt; 18アップ。 <ol><li> 36時間後、CO 2とyeastedバイアルからハエをanaesthetize。 </li><li>バイアル内部のハエを麻酔したら、解剖顕微鏡下でペイントブラシでソートするCO 2パッドの上にそれらを傾けます。 </li><li>女性を選択します。 </li><li>女性からの2の卵巣を分離します。完全な詳細なプロトコールについてはワイルらを参照してください。アル。18。要約すれ​​ば： <ol><li>第1.5、22×40ミリメートルカバースリップ上の酸素ハロカーボンオイル（シリーズ95）の小滴を置きます。 </li><li>腹部の前で鉗子で女性をつかみます。 </li><li>解剖顕微鏡下で女性を持ち、優しく女性の後部を削除するには、鉗子の第2のセットを使用します。 </li><li>第二の鉗子から後方組織を拭き取ってください。 </li><li>前方から腹部の後方への第2の鉗子を用いて腹腔に絞ります。時FEMAの外側にある半透明の卵巣が鉗子に固執する必要がありますル。 </li><li>油に卵巣をタッチします。 </li><li>鉗子を拭き取ることにより、鉗子から任意の組織を削除します。 </li><li> 3カバースリップ、1 flyから卵巣を含む各を得るために - これらの手順（2.4.7 2.4.1）を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 3.単離個々の熟卵<ol><li> 4Xに設定倍率の標準的な解剖顕微鏡下では、ステップ2.4​​からの最初のカバースリップ上で、卵管を引き裂くことにより、2つの卵巣を分離します。 </li><li>任意の卵室を穿刺しないように注意しながら、単一の卵巣の中央に閉じたピンセットをご紹介します。 </li><li>次の閉じた鉗子に卵巣の中心​​部への標準的な解剖プローブを挿入します。 </li><li>ゆっくり成熟卵（ステージ14卵室）が配置された後極に向かって卵巣を介して解剖プローブをドラッグします。 </li><li>繰り返しは3.1ステップ - 3.4 2から5回は卵巣と卵の数のサイズによって異なります。 注：CO 2の追加</サブ&gt;は、通常、予め堆積卵よりも隆起した背の付属と大きく表示されます単一の卵の堆積を引き起こします。それは既に女性の内部で起動されているので、この卵は、イメージングのために破棄されるべきです。 注：成熟卵は卵巣結合組織から容易に分離する可能性があります。 </li><li>全く成熟した卵は卵巣の外側に表示されていない場合、解剖プローブとからかっ優しく続けます。 </li><li>カバースリップの中央に一列に5 - 成熟した卵子が卵巣の外側カバースリップ上に表示されたら、3を操縦。 注：最良の結果を得るために、穏やかに卵の側面に沿ってプローブを実行します。 注：これは卵に損傷を与えることができるよう背付属を引っ張ることは避けてください。 注：将来のイメージングセットアップに応じて、最大撮影領域のためのカバーガラスに垂直に200μm程度離れて卵を合わせます。 </li><li>整列一度、Fを使用して整列卵から離れて、それをドラッグすることで、卵巣組織の残りの部分を削除しますorceps。 </li><li>ワイプ医療のコーナーで軽くたたくことにより、余分な油を削除します。医療が接触するなどの成熟卵を拭くと成熟卵を触れないように注意してくださいが失われます。 </li><li>顕微鏡下でのサンプルの位置を簡単にするためにマーカーでカバースリップ上の十字線を描画します。 </li><li>安全な場所にカバーグラスをセットし、5休まカバースリップ上に準備された卵室を残す - 10分。これは、油中に解決する卵を可能にします。試料は、1時間後の切開まで使用することができます。 </li><li>それらの上に卵巣とカバースリップの残りのための3.11 - を繰り返して、3.1を繰り返します。 </li></ol> 4.イメージングのための準備<ol><li>室温に準備されたアクティベーションバッファ15を持参してください。 注：活性化緩衝液は低張性緩衝液である：3.3ミリモルのNaH 2 PO 4、16.6 mMのKH 2 PO 4、10mMの塩化ナトリウム、50mMのKClを、5％のポリエチレングリコール8,000は、2mMのCaCl 2を 、1を用いてpHを6.4にしました。 NaOHを5比：KOH。詳細についてはMahowald、1983年15を参照してください。活性化緩衝液のアリコートを2週間までヶ月と4℃で-20℃で保存することができます。 </li><li>慎重イメージング施設に準備されたカバースリップ、活性化バッファー及びガラスピペットを輸送。 注：広視野共焦点、スピニングディスク又は光学シート用顕微鏡を使用することができます。私たちは、倒立顕微鏡を使用することをお勧めします。私たちの代表的な結果は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 </li><li>全体の成熟卵を画像化するのに適した目的は、（ここでは：20X 0.7 NA）を選択すべきです。 </li><li>顕微鏡ステージ上に最初に準備されたカバースリップをマウントします。ステージ上にカバースリップを壊さないように注意してください。 </li><li>定性的には活性化のための成熟した卵室でビューのフィールドを選択します。画像は卵室または膜中のブレブ形成を有するものがパンクしないでください。 注意：手順4.6について - 4.7、ソフトウェアコマンドは、顕微鏡やメーカーによって異なります。 </li><li>設定された撮影パラ（ - 580から500nm）標準GFPの励起（488 nm）を発光のためメートル。また、成熟した卵と変位油を可視化し、配向するために、明視野ビューを設定。 </li><li>成熟卵が表示されている最低のZ平面を選択し、ステップ当たり40マイクロメートルで約2μmのために取られるフルZスタックを設定します。 Zスタックの取得の間に遅延がないようにパラメータを設定します。約30分間キャプチャする時系列を設定します。 </li></ol> 5.イメージングex vivoで卵活性化<ol><li>画像キャプチャを開始します。 </li><li>取得する2フルZ-スタック - 1のを待ちます。これは、活性化の前に成熟した卵子を示しています。 </li><li>ガラスピペットに活性化バッファーの約300μLを撤回。 </li><li>それは成熟した卵は、撮像されているの真上になるまでカバースリップ上記45°の角度で活性化緩衝液を含むガラスピペットの先端を位置決めし、ゆっくりとビーム経路にピペッ​​トを移動します。ガラスピペットべきオイルより2センチメートル - 1です。 </li><li>ガラスピペットから5秒未満で活性化緩衝液の2滴 - 1を追加します。これは、オイルを置換する必要があります。それは成熟卵の移動を引き起こすことができるように、過剰な活性化緩衝液を追加したり、ガラスピペットで卵に触れないようにしてください。これは目的とカバーガラスとの間に液浸油に形成するために、焦点面や気泡の変化を引き起こすことができるようにピペットでカバースリップに触れないように注意してください。 </li><li>画像取得時に活性化緩衝液を添加しながら、オイルが活性化緩衝液によって変位していることを確認するために、明視野チャンネルを確認してください。 注：これは、最初のビーム経路を壊すピペットによる影として表示されますが、また、小さな油滴の外観になります。一部の油滴は、実験の結果および画像品質に影響を与える成熟した卵子に関連付けられたままにすることができます。 </li><li> 5 - 油を活性化バッファー反復の最初の添加からずれていない場合は5.4ステップ0.6。 </li><li>油が正常に変位されると、時系列が完了するまで実行することができます。 注：これにより起動時の卵母細胞の膨潤に、いくつかの卵室は、活性化緩衝液を添加すると、ビューの焦点面またはフィールドの外に劇的に移動します。この状況では、取得を停止し、次のカバースリップをマウントします。 </li><li>画像シーケンスは、買収を完了した後、データを保存します。 </li></ol> 6.買収後の画像処理<ol><li>フィジー（http://fiji.sc/Downloads#Fiji）、または同等の画像処理ソフトウェアを使用して、データセットを開き、分析のために、関連するファイルを選択します。 </li><li>取得したデータの投影を構築するために選択します。画像&gt;スタック&gt; Z-プロジェクトを。 </li><li>スタートZ-スライスとストップZ-スライス、通常、セクション全体を選択します。一般的に「最大輝度」に設定投射型を選択します。シリーズ全体に選択した設定を適用するチェックボックス「すべての時間のフレーム」を確認してください。 </li><li>もし複数の蛍光チャネルは、色間の移動を可能にする複合体を作る、または画像のグレースケールを作るためにチャンネルツールを使用して、撮像されました。画像&gt;色&gt;チャンネルツールを選択します。 </li><li>画像の明るさを調整し、選択画像を対比&gt;&gt;明るさ/コントラストを調整します。 </li><li>単一のイメージをエクスポートするには、関連するフレームおよび[ファイル]&gt; [名前を付けて保存&gt; JPEG、または任意の好適なフォーマットにタイムスケールスライダーを移動します。 </li><li>保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 イメージングソフトウェアからフレームレートが画像にタイムスタンプを付与するために必要とされることに注意してください。 </li><li>選択ムービーとして時系列をエクスポートするには：[ファイル]&gt; [名前を付けて保存&gt; AVIファイルを、フレームレート（1秒あたり〜7フレーム）を選択します。 </li><li>保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 </li><li>フィジー形式で調整されたファイルを保存するには、[ファイル]&gt; [保存します。 </li></ol>

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility.">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li><li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. 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K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs.">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).</li><li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation.">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable. 
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol. 
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer. 
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization. 
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

卵（卵母細胞）の活性化における細胞内Caの変化2+濃度は、全ての研究生物1,2の保存コンポーネントです。このイベントは、細胞周期の再開と、記憶されたmRNAの翻訳などのCa 2+依存性プロセスの広い範囲を、開始します。細胞内Ca 2+濃度の一過性の変化を可視化するのCa 2+のためのこの要件にキー注目されています。 歴史的に、モデル生物は、その卵の大きさと可用性に基づいて卵活性化の研究のために選択しました。様々な可視化手法では、次のようにシステム内の細胞内Ca 2+濃度の変化に従って、定量化するために利用されてきた：メダカ3における発光タンパク質エクオリンを、このようなフラ-2ウニとハムスター4,5のようにの Ca 2+感受性蛍光色素;そして、カルシウムグリーン1デキストランアフリカツメガエル 6インチ遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）の生成および改良は、in vivo 7 中の Ca 2+動態を可視化する能力を変えてきました。これらの遺伝子構築物は、特定の組織で発現し、侵襲性の組織標本8の必要性を制限しています。 GCaMPsは、それらの高い親和性の Ca 2+、信号対雑音比及び9-11をカスタマイズするための能力に非常に有効であった緑色蛍光タンパク質（GFP）GECIsのベースクラスです。 Ca 2+の存在下では、GCaMP複合体は、カルモジュリンへのCa 2+の結合を開始し、コンフォメーション変化のシリーズを受けることGFP部品9の蛍光強度の増加をもたらします。 GCaMPsは広く、細胞内カルシウム12の変化を可視化するために、 ショウジョウバエの神経細胞の研究に使用されています。最近のアプリケーションシート成熟したショウジョウバエの卵中のCa 2+を可視化するGCaMP技術の上で卵活性化13,14で単一の一過性のCa 2+波を明らかにしました。 Ca 2+波は、ex vivoで活性化アッセイ13,14を用いてインビボ 13 またはより高い倍率で排卵時低倍率で視覚化することができます。 ex vivoでのアッセイでは、個々の成熟した卵母細胞を卵巣から単離し、低張溶液を用いて活性化され、in vivoで活性化15-17のイベントを再現することが示されている活性化緩衝液と呼ばれます。 このex vivoのアッセイは、薬理学的破壊、物理的な操作と遺伝的変異体を含む、異なる実験条件の下でのCa 2+波の容易な高解像度の可視化を可能にします。この記事では、ex vivo活性化及び目のための成熟したショウジョウバエの卵の調製を示しますGCaMPを使用してのCa 2+波を可視化するために使用する電子その後の顕微鏡。このアプローチは、Ca 2+波の開始と制御をテストし、下流の結果を調べるために使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry active yeast</td>
			<td style="width:373px;">Fleischman&#8217;s</td>
			<td style="width:243px;">#2192</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp</td>
			<td>Mircotec Fibre optic</td>
			<td>MF0-90</td>
			<td>Various will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Medical wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Corporation</td>
			<td>KLEW3020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Marker pen</td>
			<td>Stabilo</td>
			<td>841/46</td>
			<td>OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 pad</td>
			<td>&#160;Genesee Scientific</td>
			<td>59-114 (789060 Dutscher)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm</td>
			<td>International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm</td>
			<td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;">Halocarbon oil, series 95</td>
			<td rowspan="2">Halocarbon Products Corp.</td>
			<td>Distributor in Europe:</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Solvadis (GMBH)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil 10 S</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td align="right">24627.188</td>
			<td>Can be used instead of Halocarbon oil, series 95</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Probe</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10140-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Fisherbrand,</td>
			<td>FB50251</td>
			<td>Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial</td>
			<td style="width:373px;">Regina Industries</td>
			<td style="width:243px;">P1014</td>
			<td>GPPS&#160; 80mm x 25mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium in drosophila at egg activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

ここでは、ex vivoでの活性化のために成熟したショウジョウバエの卵を準備する方法を実証しています。 GECIを発現している卵は、卵の活性化および胚発生の始まり（ 図1）でのCa 2+動態のイメージングを可能にします。ミリストイル基の存在は特に、使用GCaMPによって、結果がわずかに質的な違い13 14を有してもよいことに留意すべきである。我々はまた、アクチン重合の阻害剤を添加することによって卵の活性化の間の機能的アクチンの役割を実証しています、活性化緩衝液（ 図2）14サイトカラシンD、。 卵活性化における細胞骨格のための要件が​​保存されています。 C.でエレガンスは、受精後、細胞骨格の構成要素は、第一の非対称分裂21,22のための一細胞胚を作製するために再編成されています。ウニ​​、cytoskeleの破壊でTALの再編成次の活性化は、収縮環の形成23を防止することにより、細胞周期に影響を与えることが示されています。 ショウジョウバエの卵活性化時の Ca 2+波とその下流の機能を媒介する際のアクチンの役割は完全には解明されないままです。 ショウジョウバエでは、 の Ca 2+波とアクチン細胞骨格の同時可視化は、このエクスビボ活性化アッセイを用いて達成することができます。複数のチャンネルの時系列を取得することができ、細胞内Ca 2+の動態を、卵母細胞（ 図3）におけるアクチンの組織の変化に一致させることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" /> 図1：ex vivoでのショウジョウバエの卵活性化時系列でのシングルの Ca 2+波は、a。次UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します活性化緩衝液（AH）のddition。細胞質のCaの上昇は約1.5ミクロン/秒の平均速度で2+後極（B）に由来し、伝搬する（BF）。波の開始は、典型的には、活性化緩衝液の添加の3分以内に観察されます。活性化に続いて、成熟した卵の細胞内カルシウムレベルは、レベル（G、H）活性化の事前に戻ります。補足ムービー1（合計時間33分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" /> 図2：アクティベーションバッファ摂動CAにサイトカラシンDの追加2+ ex vivoでの波動伝播。時系列を10μg/ mlのサイトカラシンDの最終濃度（AH）を含む活性化緩衝液を添加した後UASt- myrGCaMP5を表現する ショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極（A）で開始される一方で、それが危険にさらされていると卵（F）の前方に到達していない（白矢じりは、波の前面を表します）。それ以上の Ca 2+の変化）を30分間にわたって観察されませんでした。補足ムービー2（合計時間30分）を参照してください。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" /> 図3：EでのアクチンおよびCa 2+の同時可視化ショウジョウバエのGGのアクティベーションex vivoでの。時系列は、活性化バッファー（AH）の添加後UASt- myrGCaMP5（シアン）とUASP -F-Tractin.tdTomato（マゼンタ）を発現するショウジョウバエの卵を成熟します。 Ca 2+波は後極から開始し、 図1のように回復します。アクチンが白矢頭（H 対 A）、時間の経過とともに変化しているように見えます。成熟卵の中心での Ca 2+シグナルの検出の欠如は、画像キャプチャ中にサンプルの移動によるものです。スケールバー=50μmです。 =40μmの最大投影。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。

内イメージングカルシウム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵活性化で

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

7.8K ビュー.  University of Cambridge. この記事では、 ショウジョウバエの卵活性化の間のCa 2+を可視化するための適応性のex vivoでのプロトコルについて説明します。 

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

発生生物学

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

のアップライトイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;エッグチェンバース

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

イメージングは​​、単一細胞の解像度で胚および出生後の心をクリア

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

培養ショウジョウバエ卵室のタイムラプスムービーを用いた局所細胞および組織スケールにおけるアトミオシンダイナミクスの解析

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...