近接ライゲーションアッセイまたはPLAにおける、タンパク質、貼り付けられた組織、および細胞間の相互作用を検出することができる技術である。タンパク質間の関連は、トランスジェニック発現や追加技術を必要とせずに同定および定量することができる。唯一の要件は、DNAオリゴヌクレオチドで修飾することができる特定の高効率抗体の入手可能性です。
組織ではMST1およびMST2は主に活性ホモダイマーとして存在するが、発癌性刺激はMST1 MST2ヘテロ二量体のレベルを増加させることができ、そのようなヘテロ二量体は非活性である。目的のタンパク質に対する特異的プライマー抗体とのインキュベーションに続いて、特殊な特異的二次抗体は、それぞれ、それに結合したユニークで短い、無料のDNA鎖に結合し、一次抗体に結合するためにスロットに添加される。質問中のタンパク質がヘテロ二量体化されている場合、一次抗体とそれらに結合した二次抗体の両方が近接します。
この状態では、第2抗体上に付着したDNA鎖は、その後2つの他の2つの円形成DNAオリゴヌクレオチドを添加して相互作用することができる。DNA円の数百倍の複製は、増幅反応後に起こり得、蛍光シグナルは、レベルの高い無料のオリゴヌクレオチドプローブによって生成される。そのため、検出された各信号は、顕微鏡画像に基づいて特定の細胞内の位置に割り当てることができる個々の蛍光ドットとして可視化されます。
実験の前日に、マウスラミニンまたはポリLリジンの50〜100マイクロリットルを加えて16の十分にチャンバースライドをコーティングし、摂氏37度でインキュベートします。冷たい溶液を30分除去した後、トリプシンとプレート15,000〜25,000細胞を用いて細胞を16個の十分にチャンバースライドに分割した。加湿した5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cの細胞を24時間インキュベートする。
24時間後、ウェルから培地を取り出し、PBSで細胞を静かに洗います。マイクロピペットを使用してサンプルのリスクテイクを最小限に抑え、PBSを吸引し、1ウェルあたり4%PFAの50マイクロリットルを加えて細胞を固定し、攪拌せずに室温で10分間インキュベートします。細胞の剥離をもたらす可能性があるため、溶液を細胞に直接ピペットしないでください。
固定後、TBSTで細胞をそれぞれ5分間3回軽い撹拌で洗浄します。次に細胞を透過させ、攪拌することなく室温で10分間インキュベートする。透過性が完了した後、TBSTで細胞を3回洗浄して、1回5分間攪拌します。
TBSTを取り外した後、各ウェルにブロッキング溶液の1滴を追加し、摂氏37度で1時間予熱湿度チャンバーにスライドをインキュベートします。希薄な一次抗体。マイクロピペットを使用してブロッキング溶液を取り除きますが、スライドを乾燥させないでください。
ボルテックスを適当なウェルに40マイクロリットルの希釈抗体溶液を加え、予熱湿度チャンバーで37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、2つのPLAプローブを抗体希釈剤で希釈します。各サンプルに対して40マイクロリットルのPLAプローブを調製します。
1時間のインキュベーションの後、抗体溶液を吸引し、室温でTBSTでスライドを5分間2回洗浄する。スライドからTBSTをそっと取り出し、各ウェルに40マイクロリットルのPLAプローブ溶液を加えます。予熱湿度室でスライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。
使用直前に高純度水で、結紮ストック1~5の必要量をボルテックスで希釈する。各ウェルに対して40マイクロリットルのライゲーション溶液が必要である。インキュベーション後、スライドからPLA溶液を取り出し、攪拌で室温で5分間TBSTで2回洗浄します。
冷凍庫からリガーゼを取り除く場合、細胞に加える直前に凍結ブロックを使用し、結紮溶液で希釈します。スライドからTBSTを取り出し、各ウェルに40マイクロリットルのライゲーションリガーゼ溶液を加えます。予熱湿度室で30分間、摂氏37度でスライドをインキュベートします。
インキュベーションの後、溶液を吸引し、攪拌で室温で5分間TBSTで2回洗浄する。試薬は光に敏感なので、明るい光に井戸を露出させないようにしてください。最後の洗浄時に、ボルテックスを使用する直前に高純度水で必要量の増幅液を希釈します。
ポリメラーゼを氷の上または冷却ブロックに入れ、細胞の渦に加える直前に、増幅溶液で希釈します。ウェルからTBSTを吸引し、各ウェルに40マイクロリットルの増幅溶液を加えます。暗い予熱湿度室で37°Cで100分間スライドをインキュベートします。
インキュベーション後、スライドから増幅ポリメラーゼ溶液を吸引し、室温でTBSTでそれぞれ10分間20分洗浄する。スライドからウェルの周りのチャンバーとシリコーンを完全に取り除きます。シリコーンの残りのビーズをカミソリで削り取ります。
スライド上にグリッドを描画し、各ウェルを区切ります。DAPIで約40マイクロリットルの取り付け媒体を加え、カバースリップの下に気泡が引っ掛からないようにします。マニキュアを使用してカバーガラスを固定します。
顕微鏡解析は、固定後20分で行うことができますが、実際には、次の日に画像解析を行うことが最も便利です。サンプルを分析するために、Leica SP8構成レーザー走査顕微鏡を使用します。ここに示されているのは、パネルAからDのヒト胚性腎臓細胞におけるMST 1とMST2タンパク質の間の近接を視覚化するその場合の近接ライゲーションアッセイの例であり、パネル H.In E内のヒトシュワン細胞はDAPIによって青色に染色され、赤色点は示されたタンパク質間の近接性に起因する陽性近接ライゲーションアッセイシグナルを示す。
パネルAはMST1とMST2の近接性を示し、パネルBは、これらのエピトープが同じタンパク質上にあるため、ERKとホスホエルKの近接性を示す。パネルCは、MST1およびMST2およびパネルDのようなこれらの細胞が互いに近接するとは予想されないMST1およびERKに対する抗体で染色された第2の陰性対照を表すので、陰性対照を表す。パネルEおよびFは、シュワン細胞におけるホスホエルクを有するMST2およびERKとのMST1の近接性を示す。
パネルGおよびHは、MST1抗体またはMST1およびERK抗体でのみ染色される陰性対照である。ヘテロダイマーの1つのメンバーのみを認識する必要がある非交差反応性の一次抗体を使用することが不可欠です。また、一次抗体とPLAプローブの交差汚染を避け、ウェルの底部に触れないように、サンプルに直接ピペットを避けるために、異なるヒントを使用することを忘れないでください。
このビデオを見た後、固定細胞のタンパク質二量体化を研究するために現場でPLAを使用する方法をよく理解する必要があります。.
