In situ Близость Лигация Анализ или НОАК, является технология, способная обнаруживать взаимодействия между белками, прикрепленные ткани, и клетки. Связи между белками могут быть определены и количественно без необходимости трансгенного выражения или дополнительных технологий. Единственным требованием является наличие специфических высок эффективности антител, которые могут быть изменены с помощью олигонуклеотидов ДНК.
В тканях MST1 и MST2 существуют в основном как активные гомодимеры, но онкогенные стимулы могут повысить уровень гетеродимеров MST1 MST2 и такие гетеродимеры неактивны. После инкубации с конкретными антителами грунтовки против белков, представляющих интерес, специальные специфические вторичные антитела, каждый из которых связан с уникальной, короткой, бесплатной нити ДНК прилагается к нему, добавляются в слот, чтобы связать с первичными антителами. Если белки в вопросах гетенодимеризированы, как первичные антитела, так и вторичные антитела, связанные с ними, будут в непосредственной близости.
В этом состоянии прикрепленные нити ДНК на вторых антителах могут взаимодействовать через последующее добавление двух других кругообразующих олигонуклеотидов ДНК. Несколько сотенкратная репликация круга ДНК может произойти после реакции усиления и флуоресценции сигнал генерируется выравнивается бесплатный олигонуклеотид зондов. Таким образом, каждый обнаруженный сигнал визуализируется как индивидуальная флуоресцентная точка, которая может быть назначена в определенном подклеточном месте на основе изображений микроскопа.
За день до эксперимента, пальто 16 хорошо камерных слайдов, добавив от 50 до 100 микролитров мыши ламинина или поли-L-лизина и инкубировать при 37 градусов по Цельсию. Через 30 минут удалите холодный раствор, разделите клетки с помощью трипсина и пластины от 15 000 до 25 000 клеток на 16 хорошо камерных слайдов. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в увлажненные 5%углекислый газ инкубатор в течение 24 часов.
Через 24 часа, удалить среду из колодцев и аккуратно промыть клетки с PBS. Используйте micropipette, чтобы свести к минимуму риск принятия образца затем аспирировать PBS и исправить клетки, добавив 50 микролитров 4%PFA на колодец и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре без агитации. Не пипетки раствор непосредственно на клетки, так как это может привести к отслоею клеток.
После фиксации, мыть клетки с TBST три раза в течение пяти минут каждый с легким возбуждением. Далее пронизывают клетки и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре без возбуждения. После завершения протеабилизации промыть клетки с TBST три раза в течение пяти минут за стирку с возбуждением.
После удаления TBST добавить одну каплю блокирующего раствора в каждую колодец и инкубировать горки в камере предварительно разогретой влажности в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Разбавить первичные антитела. Удалите блокирующий раствор с помощью микропайетта, но не позволяйте слайдам высохнуть.
Vortex и добавить 40 микролитров разбавленного раствора антитела в соответствующие скважины и инкубировать образцы при 37 градусов по Цельсию в предварительно разогретой камере влажности в течение одного часа. Во время инкубации разбавьте два зонда НОАК в разбавляющий антитела. Для каждого образца готовят 40 микролитров зонда НОАК.
После одного часа инкубации, аспирировать раствор антитела и мыть слайды дважды в течение пяти минут с TBST при комнатной температуре. Аккуратно удалите TBST со слайдов и добавьте 40 микролитров раствора зонда НОАК к каждой колодец. Инкубировать горки в камере разогретой влажности в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.
Vortex и разбавить необходимые объемы перевязки бульона от 1 до 5 в высокой чистоте воды непосредственно перед использованием. Для каждой колодец требуется 40 микролитров раствора перевязки. После инкубации снимите раствор НОАК со слайдов и дважды промойте их в ТБСТ в течение пяти минут при комнатной температуре с возбуждением.
Используйте замораживающий блок при удалении лигазы из морозильной камеры и перед добавлением его в клетки, вихрь и разбавить его с перевязки раствора. Удалите TBST со слайдов и добавьте 40 микролитров раствора перевязки лигазы к каждой колодец. Инкубировать слайды в камере разогретой влажности в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию.
После инкубации аспирировать раствор и мыть дважды с TBST в течение пяти минут при комнатной температуре с возбуждением. Избегайте подвергая хорошо яркий свет, как реагенты светочувствительны. Во время последней стирки вихрь и разбавляют необходимое количество раствора усиления в высокой чистоте воды непосредственно перед использованием.
Держите полимеразу на льду или в охлаждающем блоке и перед тем, как добавить ее в вихрь клеток и разбавить раствором усиления. Аспирировать TBST из скважин и добавить 40 микролитров усиления раствора для каждой скважины. Инкубировать слайды в темной камере разогретой влажности в течение 100 минут при 37 градусах по Цельсию.
После инкубации аспирировать раствор полимеразы усиления со слайдов и мыть два раза по десять минут каждый при комнатной температуре. Удалите камеры и силикон вокруг колодцев с горки полностью. Соскречьте оставшиеся бусинки из силикона бритвой.
Нарисуйте сетку на слайде, разделяющей каждую колодец. Добавьте около 40 микролитров монтажной среды с DAPI, гарантируя, что пузырьки воздуха не будут пойманы под крышкой скольжения. Используйте лак для ногтей, чтобы исправить крышку стекла.
Микроскопический анализ может быть выполнен в течение 20 минут после фиксации, но на практике мы находим наиболее удобным для выполнения анализа изображения на следующий день. Для анализа образцов мы используем лазерный сканирующий микроскоп Leica SP8. Здесь приведены примеры на месте близости перевязки анализа визуализации непосредственной близости между MST 1 и MST2 белков в эмбриональных клетках почек человека в панелях A через D, и человека Schwann клетки в панелях E через H.In все панели ядра клеток окрашены синим DAPI и красные точки указывают на положительную близость перевязки сигналов в результате близости между указанными белками.
Панель А показывает близость MST1 и MST2 и панель B показывает близость ERK и phosphoERK, поскольку эти эпитопы находятся на том же белке. Панель C представляет собой отрицательный контроль, поскольку эти клетки, такие как MST1 и MST2 и Группа D представляет собой второй отрицательный контроль, окрашенный антителами для MST1 и ERK, которые, как ожидается, не будут в непосредственной близости друг от друга. Панели E и F показывают близость MST1 с MST2 и ERK с phosphoERK в клетках Шванн.
Панель G и H являются отрицательными контроля окрашены только с антителами MST1 или с MST1 и ERK антител. Крайне важно использовать не кросс-реактивных первичных антител, что он должен признать только один член гетенодимера. Также важно помнить, чтобы использовать различные советы, чтобы избежать перекрестного загрязнения первичных антител и PLA зондов, чтобы избежать прикосновения к нижней части хорошо, и, чтобы избежать трубопроводов непосредственно на образцах.
После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать in situ PLA для изучения белка димеризации в фиксированных клетках.
