O in situ Proximity Ligation Assay ou PLA, é uma tecnologia capaz de detectar interações entre proteínas, tecido afixado e células. As associações entre proteínas podem ser identificadas e quantificadas sem a necessidade de expressão transgênica ou tecnologias adicionais. O único requisito é a disponibilidade de anticorpos específicos de alta eficiência que podem ser modificados com oligonucleotídeos de DNA.
Nos tecidos MST1 e MST2 existem principalmente como homodimers ativos, mas estímulos oncogênicos podem aumentar o nível de heterídmeros MST1 MST2 e tais heterodimers estão inativos. Após a incubação com anticorpos específicos de primer contra as proteínas de interesse, anticorpos secundários específicos especiais, cada um ligado a uma única, curta e complementar cadeia de DNA anexada a ele, são adicionados ao slot para se ligar aos anticorpos primários. Se as proteínas em questão forem heterodimerizadas, tanto os anticorpos primários quanto os anticorpos secundários ligados a eles estarão próximos.
Neste estado, os fios de DNA anexados no segundo anticorpos podem interagir através de uma adição subsequente de dois outros oligonucleotídeos de DNA formadores de círculos. Várias centenas de duplicações do círculo de DNA podem ocorrer após uma reação de amplificação e um sinal de fluorescência é gerado por sondas de oligonucleotídeos de cortesia niveladas. Portanto, cada sinal detectado é visualizado como um ponto fluorescente individual que pode ser atribuído a um local subcelular específico com base em imagens de microscópio.
No dia anterior ao experimento, cubra 16 slides bem-câmaras adicionando 50 a 100 microliters de laminina de rato ou poli-L-lysina e incubar a 37 graus Celsius. Após 30 minutos remova a solução fria, divida as células usando Trypsin e placa 15.000 a 25.000 células por poço em 16 slides bem-câmara. Incubar células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Após 24 horas, retire o meio dos poços e lave suavemente as células com PBS. Use uma micropipette para minimizar a tomada de risco da amostra e, em seguida, aspire o PBS e fixar células adicionando 50 microliters de 4%PFA por poço e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Não encodou a solução diretamente nas células, pois isso pode resultar em descolamento das células.
Após a fixação, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos cada uma com leve agitação. Em seguida, permeabiliar as células e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após a conclusão da permeabilização, lave as células com TBST três vezes por cinco minutos por lavagem com agitação.
Depois de remover o TBST adicione uma gota de solução de bloqueio em cada poço e incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius. Diluir anticorpos primários. Remova a solução de bloqueio usando uma micropipette, mas não permita que slides sequem.
Vórtice e adicione 40 microlitadores da solução de anticorpos diluídos aos poços apropriados e incubar as amostras a 37 graus Celsius em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora. Durante a incubação, diluir as duas sondas PLA em diluição de anticorpos. Para cada amostra prepare 40 microliters da sonda PLA.
Após uma hora de incubação, aspire a solução de anticorpos e lave duas vezes por cinco minutos com TBST em temperatura ambiente. Remova suavemente o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução da sonda PLA a cada poço. Incubar os slides em uma câmara de umidade pré-aquecido por uma hora a 37 graus Celsius.
Vórtice e diluir os volumes necessários do estoque de ligadura 1 a 5 em água de alta pureza imediatamente antes do uso. 40 microliters da solução de ligadura são necessários para cada poço. Após a incubação, remova a solução PLA dos slides e lave-as duas vezes em TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação.
Use um bloco de congelamento ao remover o ligase do congelador e pouco antes de adicioná-lo às células, vórtice e diluí-lo com a solução de ligadura. Remova o TBST dos slides e adicione 40 microliters da solução ligase de ligadura a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação aspire a solução e lave duas vezes com TBST por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação. Evite expor o poço à luz brilhante, pois os reagentes são sensíveis à luz. Durante a última lavagem, o vórtice e diluir os volumes necessários da solução de amplificação em água de alta pureza imediatamente antes do uso.
Mantenha a polimerase no gelo ou em um bloco de resfriamento e pouco antes de adicioná-la ao vórtice das células e diluir com a solução de amplificação. Aspire o TBST dos poços e adicione 40 microliters de solução de amplificação a cada poço. Incubar lâminas em uma câmara de umidade pré-aquecido escuro por 100 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação, aspire a solução de polimerase de amplificação a partir dos slides e lave duas vezes dez minutos cada em TBST à temperatura ambiente. Remova as câmaras e o silicone ao redor dos poços do escorregador completamente. Raspe as contas restantes de silicone com uma navalha.
Desenhe uma grade no slide separando cada poço. Adicione aproximadamente 40 microliters do meio de montagem com DAPI, garantindo que nenhuma bolha de ar fique presa sob o deslizamento da tampa. Use esmalte para fixar vidro de cobertura.
A análise microscópica pode ser realizada em 20 minutos após a fixação, mas na prática achamos mais conveniente realizar a análise de imagem no dia seguinte. Para analisar as amostras, usamos um microscópio de varredura a laser Leica SP8. Aqui são mostrados exemplos de ensaio de ligadura de proximidade in situ visualizando proximidade entre proteínas MST 1 e MST2 em células renais embrionárias humanas em painéis de A a D, e células de Schwann humanos nos painéis E através de H.In todos os núcleos celulares de painéis são manchados de azul por DAPI e pontos vermelhos indicam sinais positivos de proximidade de ligas de proximidade resultantes da proximidade entre as proteínas indicadas.
O painel A mostra proximidade de MST1 e MST2 e painel B mostra proximidade de ERK e fosfoERK, pois esses epítopos estão na mesma proteína. O painel C representa um controle negativo, pois essas células como MST1 e MST2 e Painel D representam um segundo controle negativo manchado com anticorpos para MST1 e ERK que não se espera estar próximos um do outro. Os painéis E e F mostram proximidade de MST1 com MST2 e ERK com fosfoERK em células Schwann.
Painel G e H são controles negativos manchados apenas com anticorpos MST1 ou com anticorpos MST1 e ERK. É imperativo usar anticorpos primários não reativos que devem reconhecer apenas um membro do heterodimer. Também é importante lembrar de usar diferentes pontas para evitar a contaminação cruzada de anticorpos primários e sondas PLA, para evitar tocar na parte inferior do poço, e evitar a tubulação diretamente em amostras.
Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como usar in situ PLA para estudar dimerização de proteínas em células fixas.
