Der in situ Proximity Ligation Assay oder PLA ist eine Technologie, die in der Lage ist, Wechselwirkungen zwischen Proteinen, anbefestem Gewebe und Zellen zu erkennen. Die Assoziationen zwischen Proteinen können identifiziert und quantifiziert werden, ohne dass eine transgene Expression oder zusätzliche Technologien erforderlich sind. Die einzige Voraussetzung ist die Verfügbarkeit spezifischer hocheffizienter Antikörper, die mit DNA-Oligonukleotiden modifiziert werden können.
In Geweben existieren MST1 und MST2 hauptsächlich als aktive Homodimere, aber onkogene Reize können den MST1-MST2-Heterodimer erhöhen und solche Heterodimere sind inaktiv. Nach der Inkubation mit spezifischen Primer-Antikörpern gegen die Proteine von Interesse werden spezielle spezifische sekundäre Antikörper, die jeweils mit einem einzigartigen, kurzen, kostenlosen DNA-Strang verbunden sind, dem Steckplatz hinzugefügt, um an die primären Antikörper zu binden. Wenn die in Frage stehenden Proteine heterodimerisiert sind, befinden sich sowohl die primären Antikörper als auch die an sie gebundenen sekundären Antikörper in unmittelbarer Nähe.
In diesem Zustand können die angehängten DNA-Stränge an den zweiten Antikörpern durch eine nachfolgende Zugabe von zwei anderen kreisbildenden DNA-Oligonukleotiden interagieren. Nach einer Amplifikationsreaktion kann eine mehrfache Replikation des DNA-Kreises erfolgen und ein Fluoreszenzsignal wird durch nivellierte komplementäre Oligonukleotid-Sonden erzeugt. Daher wird jedes erkannte Signal als einzelner Fluoreszenzpunkt visualisiert, der auf Derbfolge von Mikroskopbildern einer bestimmten subzellulären Position zugeordnet werden kann.
Am Tag vor dem Experiment 16 gut gekammerte Dias überziehen, indem man 50 bis 100 Mikroliter Mauslaminin oder Poly-L-Lysin hinzufügt und bei 37 Grad Celsius brütet. Nach 30 Minuten kalte Lösung entfernen, teilen Sie die Zellen mit Trypsin und Platte 15, 000 bis 25, 000 Zellen pro Well in 16 gut gekammerte Rutsche. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator für 24 Stunden.
Nach 24 Stunden das Medium aus den Brunnen entfernen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Risikoaufnahme der Probe zu minimieren, dann die PBS zu aspirieren und Zellen zu fixieren, indem Sie 50 Mikroliter 4%PFA pro Bohrkörper hinzufügen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung inkubieren. Pipette die Lösung nicht direkt auf die Zellen, da dies zu einer Ablösung der Zellen führen kann.
Waschen Sie die Zellen nach der Fixierung dreimal für jeweils fünf Minuten mit leichter Rührung mit TBST. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Rührung. Nachdem die Permeabilisierung abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen mit TBST dreimal für fünf Minuten pro Waschgang mit Rührung.
Nach dem Entfernen von TBST fügen Sie einen Tropfen Blockierlösung in jeden Brunnen und inkubieren Sie die Dias in einer vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Verdünnung primärer Antikörper. Entfernen Sie die Blockierlösung mit einer Mikropipette, lassen Sie die Dias jedoch nicht trocknen.
Vortex und fügen Sie 40 Mikroliter der verdünnten Antikörperlösung in die entsprechenden Brunnen und inkubieren die Proben bei 37 Grad Celsius in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde. Während der Inkubation die beiden PLA-Sonden in Antikörperdilutant verdünnen. Für jede Probe bereiten 40 Mikroliter PLA-Sonde.
Nach einer Stunde Inkubation die Antikörperlösung ansaugen und mit TBST bei Raumtemperatur zweimal für fünf Minuten mit Rutschen waschen. Entfernen Sie den TBST vorsichtig von den Dias und fügen Sie jedem Bohrloch 40 Mikroliter der PLA-Sondenlösung hinzu. Inkubieren Sie die Dias in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.
Vortex und verdünnen Sie die erforderlichen Mengen des Ligationsbestandes 1 bis 5 in hochreinem Wasser unmittelbar vor Gebrauch. Für jeden Brunnen werden 40 Mikroliter der Ligationslösung benötigt. Nach der Inkubation die PLA-Lösung von den Dias entfernen und zweimal in TBST fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Rührung waschen.
Verwenden Sie einen Gefrierblock, wenn Sie Ligase aus dem Gefrierschrank entfernen und kurz vor dem Hinzufügen zu den Zellen, Wirbel und verdünnen Sie es mit der Ligationslösung. Entfernen Sie den TBST von den Dias und fügen Sie 40 Mikroliter der Ligationligase-Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Gleitet in einer vorgeheizten Feuchtigkeitskammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Lösung aspirieren und zweimal mit TBST für fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Rührung waschen. Vermeiden Sie es, den Brunnen hellem Licht auszusetzen, da die Reagenzien lichtempfindlich sind. Während der letzten Wäsche, Wirbel und verdünnen Sie die Bedarfsvolumina der Amplifikationslösung in hochreinem Wasser unmittelbar vor Gebrauch.
Bewahren Sie die Polymerase auf Eis oder in einem Kühlblock auf und fügen Sie sie kurz vor dem Hinzufügen in den Zellwirbel auf und verdünnen Sie sie mit der Amplifikationslösung. Aspirieren Sie das TBST aus den Brunnen und fügen Sie 40 Mikroliter Verstärkungslösung zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Gleitet in einer dunklen vorgewärmten Feuchtigkeitskammer für 100 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation die Amplifikationspolymerase-Lösung aus den Dias aspirieren und jeweils zweimal zehn Minuten in TBST bei Raumtemperatur waschen. Entfernen Sie die Kammern und Silikon um die Brunnen von der Rutsche vollständig. Die restlichen Silikonperlen mit einem Rasiermesser abkratzen.
Zeichnen Sie ein Raster auf der Folie, das jeden Brunnen trennt. Fügen Sie ca. 40 Mikroliter des Montagemediums mit DAPI hinzu, damit keine Luftblasen unter dem Deckschein gefangen werden. Verwenden Sie Nagellack, um Deckglas zu fixieren.
Mikroskopische Analysen können in 20 Minuten nach der Fixierung durchgeführt werden, aber in der Praxis finden wir es am bequemsten, Bildanalysen am nächsten Tag durchzuführen. Zur Analyse der Proben verwenden wir ein Leica SP8-Konfigurationslasermikroskop. Hier sind Beispiele für in situ-Nähe Ligation assay Visualisierung der Nähe zwischen MST 1 und MST2 Proteine in menschlichen embryonalen Nierenzellen in den Paneelen A bis D, und Human Schwann Zellen in Panels E durch H.In alle Panels Zellkerne sind blau durch DAPI gefärbt und rote Punkte zeigen positive Nähe Ligation Assay Signale aus der Nähe zwischen den angegebenen Proteinen.
Panel A zeigt die Nähe von MST1 und MST2 und Panel B zeigt die Nähe von ERK und PhosphoERK, da sich diese Epitope auf demselben Protein befinden. Panel C stellt eine negative Kontrolle dar, da diese Zellen wie MST1 und MST2 und Panel D eine zweite negative Kontrolle darstellen, die mit Antikörpern für MST1 und ERK gefärbt ist, von denen nicht erwartet wird, dass sie in der Nähe zueinander liegen. Die Panels E und F zeigen die Nähe von MST1 mit MST2 und ERK mit PhosphoERK in Schwann-Zellen.
Panel G und H sind Negativkontrollen, die nur mit MST1-Antikörpern oder mit MST1- und ERK-Antikörpern gebeizt werden. Es ist zwingend erforderlich, nicht-kreuzreaktive primäre Antikörper zu verwenden, dass nur ein Mitglied von Heterodimer erkannt werden sollte. Auch ist es wichtig, verschiedene Tipps zu verwenden, um Kreuzkontamination von primären Antikörpern und PLA-Sonden zu vermeiden, um zu vermeiden, den Boden des Brunnens zu berühren, und um Pipettieren direkt auf Proben zu vermeiden.
Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in situ PLA verwendet, um die Proteindimerisierung in festen Zellen zu untersuchen.
