細菌の活用頻度の高解像度の比較

この方法は、プラスミドDNAが異なる細菌間で広がる頻度に関する微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、背景を縮小することで、高解像度で共役周波数の小さな違いを検出できることです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生である柳屋康介です。

最も可能性の高い数で共役頻度を計算するには、ちょうど示したように、摂氏30度で45分間、一晩のレシピエント培養から1ミリリットルの一晩ドナー培養から1ミリリットルを濾過する。共培養がインキュベートされている間、ドナールリアスープ、またはLB、カナマイシン、またはレシピエントLBプラスゲンタマイシンプレートに30°Cで2日間培養するために、三重にめっきするための元のドナーおよびレシピエント培養物を連続して希釈する。インキュベーションの終了時に、カナマイシンおよびゲンタマイシンを含む無菌LBのフィルター上の培養を、4倍に96ウェル細胞培養プレートで連続希釈するために再中断する。

摂氏30度で2日後、ドナーとレシピエント寒天プレートのコロニー形成単位(CFUs)と、光顕微鏡でトランスコンジュタントが成長する井戸の数を手動で数えます。最も可能性の高い数値とその偏差を計算するには、MPN 計算プログラムを開きます。実験の名前と日付、テストシリーズの数、およびスプレッドシート ファイルのプログラム シートの 7 行目の希釈の最大数を入力します。

自動生成された入力データテーブルで、希釈係数 D 列に式を入力し、0.01 をミリリットルまたは GW 列の体積に、チューブ N 列の数に 4 を入力します。各サンプル希釈でトランスコンジュタントが成長したウェルの数を入力し、計算結果をクリックして、ミリリットル当たりの最も可能性の高い数、および上限と下限95%の信頼限界として結果を得ます。次に、トランスコンジュガントの数を、1ミリリットル当たりのドナーおよびレシピエントコロニー形成単位の数で割り、プラスミドの結合頻度を算出する。

この代表的な実験では、pBP136:gfpプラスミドに導入された培養物に対してゼロと400RPMの間で観察されたコンジュゲーション周波数の最大差を伴い、pCAR1:gfpプラスミドに導入された培養物ではゼロから200RPMの間で、両方のプラスミドの結合頻度が高い速度で増加しました。結合の確率を比較するために必要なレシピエント細胞の密度を決定するために、交配アッセイは異なるドナーおよびレシピエント密度で行った。この代表的な実験では、pBP136:gfpトランスコンジュガントは、ドナーの10〜3番目のCFUを1回、レシピエントの第7CFUに10〜1回10〜1回を含むウェルの100%、および1回のドナーの第2CFUに10回、1回10回を有する方から7番目のCFUに検出された。の値は、セル密度が高すぎることを示します。

しかし、レシピエントのドナーの10 CFUと6番目または10〜5番目のCFUとの交配アッセイは、トランスコンジュガント陽性ウェルの数を減少させた。従って、レシピエントの10〜5番目のCFUは、単一のドナー細胞との交配に必要であると予測された。ドナー株とレシピエント株の異なる密度でpCAR1:gfpとの交配アッセイは同様の知見を示したが、全体的にトランスコンジュガント陽性ウェルの割合はpBP136:gfpの割合よりもはるかに低かった。

ドナー細胞とレシピエント細胞が同様に互いに結合できると仮定すると、pCAR1ドナーに対する結合開始の確率はpBP136ドナーに比べて低かった。これらの結果に基づいて、FACSによってソートされた単一のドナー細胞に対して、レシピエントの7番目のCFUに10が必要であると推定された。トランスコンジュガント陽性ウェルの数を数えた後、pBP136:gfpのトランスコンジュガント陽性ウェルの割合はpCAR1:gfpの場合よりも大きいと判断され、ドナーがこれら2つのプラスミド間の結合を開始する確率の36倍以上の差を示した。

手順を試みている間、常に慎重に細菌混合物を希釈することを忘れないでください。