この新しい方法論は、我々は、安定した細胞-細胞接触を確立することにより、非特異的親水性ポリマーを含む水性緩衝液中で、所望の個々の細胞から適応した三次元集合体を構築することを可能にする。このビデオでは、目的の単一細胞を操作し、人工足場を使わずに3Dセルラーアセンブリを構築する方法を紹介します。ここでは、Dextranを例に用いた培地の実験手順を示します。
まず、NAMRUマウス乳腺上皮細胞を5ミリリットルのDMEM(10%FBSおよび1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含む)を2〜3日間25立方センチメートルフラスコで維持する。続行する準備ができたら、アスピレーターを使用して補充されたDMEMを取り除き、3〜5ミリリットルのPBSを加え、それは細胞を洗浄するために摂氏37度に予熱されます。アスピレーターを使用して、フラスコからPBSのすべてを取り除く。
摂氏37度で予熱されたトリプシンを1.5ミリリットル加えます。37°CのCO2インキュベーターで少なくとも1〜2分間インキュベートします。この後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEMの3.5ミリリットルを追加します。
ピペットを上下に混ぜ合わせます。細胞懸濁液を15ミリリットルの遠心分離管に移し、417倍Gで室温で3分間遠心分離する。次いで、培地を吸引する。
10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを含む新鮮なDMEMを5ミリメートル追加します。必要に応じて、凍結保存ソリューションを使用して、メーカーの指示に従って細胞を凍結保存します。最初に10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを0.8グラムのデキストランで補ったDMEMの10ミリリットルを混ぜ、1ミリリットルのデキストラン溶液あたり80ミリグラムを調製する。
このDextran溶液の200マイクロリットルを、以前に調製した細胞懸濁液の200マイクロリットルと混合し、1ミリリットルのデキストラン培地あたり40ミリグラムを含む細胞懸濁液を作成する。まず、レーザーをオンにし、赤から近赤外領域の波長を持つレーザー光を使用することが最も効果的であることに注意してください。次に、ソフトウェアアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。
カメラのアイコンをダブルクリックすると、対応するディスプレイがポップアップ表示されます。次に、発光ダイオードのアイコンをダブルクリックし、フォーカスを調整し、移動ステージをクリックしてディスプレイを開きます。最初に2つのガラススペーサーを底カバーガラススライドの上に置きます。
20マイクロリットルを移し、以前に調製したデキストラン補充セル懸濁液をボトムカバーガラススライド上に移す。その後、上部カバーガラススライドをセルサスペンションを覆うスペーサーの上に置きます。水浸漬顕微鏡用蒸留水10マイクロリットルでサンプルセルを低対物レンズに載せよ。
10マイクロリットルの蒸留水を使用して、サンプルセルの上部に上方対レンズを取り付けます。次に、顕微鏡照明ウィンドウのオンオフボタンをクリックして、LED をオンにします。目的の位置指定ウィンドウの方向ボタンをクリックして、サンプルと低い対物レンズの間の距離を、焦点が合うまで調整します。
各レーザー光の強度を、信号減衰ウィンドウで1500ミリワットに設定します。次に、2 つのレーザー アイコンをクリックして、1 番目の位置と 2 番目の位置にレーザー光線を照射します。サンプル位置指定ウィンドウの方向ボタンをクリックして、セルが位置 1 に閉じ込められるまでサンプルステージを移動します。
2 番目の位置を示すカーソルをクリックしてドラッグし、別のセルが 2 番目の位置に閉じ込められます。まず、1 つのセルを操作して、別のセルと接触するようにします。この状態を 300 秒間維持し、セルがレーザーにさらされるように 300 秒間続けます。
x-y 軸を記録します。別のセルをトラップして最初の 2 つのセルに転送し、任意の 2D セル アセンブリを構築します。次に、ステージを上下に動かして、3D セルラー アセンブリを構築します。
レーザーの電源を切ってもアセンブリが安定していることを確認します。本研究では、可溶性ポリマーが3D単細胞集合体の構築に使用される。二重ビーム光ピンセットを用いて形成された構造の例を以下に示す。
実験が成功した場合、これらのセルラーアセンブリはレーザーの電源を切っても安定したままです。この新しい方法論は自然親水性ポリマーを含む水性媒体の3D細胞アセンブリの構築のための。再生医療や組織工学の分野で、強力なツールを備えた次世代セルラーアセンブリの建設を開始することが期待されています。
