Name: expression and purification of mammalian bestrophin ion channels
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

Bu proje NIH hibe EY025290, GM127652 ve Rochester başlangıç finansman Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. BacMam ifade Baculoviruses üreten
<ol><li>BacMam vektör18 GFP 10 tarafından izleyen bir tütün Etch virüs (TEV) proteaz tanıma dizisi ile pEG istenen memeli bestrophin protein kodlama dizisi takın O'nun etiketi-protein C terminus x.</li>
	<li>Geçici ifade plazmid yapıştırıcı HEK293 hücreleri19,20,21,22,23transfect. Ifade 10 X veya 20 X büyütme, 488 nm uyarma kaynak ve 510 nm Emisyon filtre (Şekil 1A) Floresan mikroskop altında GFP-füzyon proteinin denetleyin. Not: Polimer esaslı transfection düzenli olarak plazmid DNA HEK293 hücrelerinin bir 35 mm yemek için 1 μg ile gerçekleştirilir.</li>
	<li>Sf9 böcek hücrelerinde baculoviruses yukarıda açıklanan16,17olarak üretmek. Not: Bölüm 3 (P3) HEK293-F hücrelerin protein üretimi için bulaştırmak için kullanılacak, virüs 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanabilir.</li>
	<li>P3 virüs titresi (bulaşıcı adet) tarafından plak oluşumu tahlil16,17belirlemek. Not: ilgi protein GFP ile etiketlenir, bulaşıcı birimleri kontrol etmek için daha hızlı bir yöntem Sf9 hücreleri ile seri dilutions virüs bulaştırmak ve 48 saat sonra floresan hücreleri saymak gibidir.</li>
</ol>2. protein ifade
<ol><li>HEK293-F ifadenin orta 37 ° C oksijen kuluçka % 8 CO2HEK293-F hücrelerle süspansiyon kültürü korumak. Daha kültür Hacim 2 - 2.5 kat daha büyük olan ve kültür 135 devirde yörünge bir platformda döndürmek tek kullanımlık kültür şişeler kullanın. Not: Bu pasajlar 5 ve 30 arasında olduklarında enfekte hücreleri ve hücre kültür başlık altında bu eylemleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.</li>
	<li>24 saat önce viral enfeksiyon, Trypan mavi, 15 μL hücre kültürü için bir 15 μL aliquot ekleyin ve hücre yoğunluğu ve mikroskop altında bir hemasitometre kullanarak canlılığı denetleyin. 0,6 x 106 hücre/mL 2 x 2 L şişeler her biri, 500 mL orta önceden 37 ° C'de ısındı hücrelere sulandırmak Not: Ölü hücreleri mavi Trypan tarafından mavi lekeli. İstenen hücre canlılık olduğunu > % 95.</li>
	<li>Enfeksiyon günü, hücre yoğunluğu ve canlılığı (adım 2.2) denetleyin. Not: Bir yüksek hücre canlılığı > % 95 verimli enfeksiyon ve protein ifade için esastır. ~1.0 x 106 hücre/mL (2 x 500 mL 0,6 x 106 hücre/mL hücre kültürü yetişkin gecede) beklenen cep yoğunluğudur. Hücre beklenen toplam sayısı ~1.0 x 109' dur.</li>
	<li>P3 baculoviruses enfeksiyonu (MOI) 5 çokluğu, hücreleri ekleyin. Aşılamak için virüs miktarı belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>Bir oksijen 37 ° C kuluçka % 8 CO2 24 h 135 rpm'de yörünge platformda hücreleri sallamayın.</li>
	<li>Sodyum bütrat 10 mM hücre kültürü ekleyin ve 48 h için kuluçka devam edin. Not: Sodyum bütrat ek ifade ve istikrarı geliştirmek sonra bazı proteinler, hücre kültürü sıcaklığı 30 ° C ile azaltılması.</li>
	<li>10 X-20 X büyütme, 488 nm uyarma kaynak ve 510 nm Emisyon filtre ile floresan mikroskop altında yüzde ve parlaklık doğrudan protein (bestrophin-GFP-10xHis) verim (Şekil 1B) temsil eden yeşil hücre kontrol. Not: Yeşil hücre yüzdesi tarafından hesaplanır: (yeşil hücreler/toplam hücreleri) x 100. İyi protein ifade düzeyi güçlü yeşil floresan mikroskop altında gösterilir.</li>
	<li>1000 x g 20 dk. Kaldır süpernatant 4 ° c de centrifuging tarafından hücreleri hasat ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) ~ 80 mL son hacmiyle ile yeniden askıya alma. Split 2 x 50 mL konik boru ve 1000 x g 4 ° c de 20 dakika süreyle santrifüj içine hücre süspansiyon hücre granül-80 ° C'de depolamak</li>
</ol>3. protein saflaştırma
<ol><li>Onlar çözülme 10-15 dakika oda sıcaklığında coşkulu bir su banyosunda hücre granül içeren konik tüpler kuluçkaya. 2 x (w/v) hacmi İndinavir inhibitörleri (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin A ve phenylmethylsulfonyl florür) ile desteklenmiş arabellek (Tablo 1) (Örneğin, hücre Pellet arabellek 20 ml 10 g) hücrelerde 0.1-1.0 yeniden askıya mM. Yukarı ve aşağı damlalıklı kapsamlı bir homojen hücre süspansiyon elde etmek için.</li>
	<li>Yüksek basınçlı bir homogenizer kullanarak hücreleri parçalayıcı. Hücre süspansiyon koşmak-den geçerek homogenizer, 7-10 MPa toplamda 3 - 4 kez tam homojenizasyon elde etmek için. Hücre lysate 2-3 dakika arasında tur için buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Deterjan [Örneğin, % 2 w/v sol-grade n-Lauryl-β-D-Maltopyranoside (demir)] lysate hücreye ekleyin. 20 ° C'de membran proteinlerinin ayıklamak için 1 h için ajitasyon ile kuluçkaya. Not: Deterjan türü her protein hedef18,24için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Bir ultracentrifuge 4 ° c için 1 h 150.000 x g, santrifüj kapasitesi. Not: Aşağıdaki adımları 4 ° C'de gerçekleştirilir</li>
	<li>Açik Hücre lysate ve bunun üzerinden 5 mL O'nun tuzak Ni2 +- NTA benzeşme sütun ile tampon (Tablo 1) önceden equilibrated akış toplamak. Not: Santrifüjü sonra Açik Hücre lysate Pelet alt ve üst bulutlu bir katmanda arasında sıkışmış. 10 mL transfer damlalıklı dikkatle net lysate toplamak ve sonra 1 mL damlalıklı son birkaç lysate mililitre geçmek için kullanın. Ni2 + sütun yapışmasına neden olabilir Pelet kaçının; Ancak, küçük bir miktar üst tabaka yolunda veya 1,5 mikron filtre ile filtre uygulanabilir.</li>
	<li>Sütun arabelleği B 25 mL ve sonra arabellek C 40 mL ile yıkayın (Tablo 2 ve 3, sırasıyla). Not: Bu gibi toplam arıtma en fazla 12 saat sürebilir ve protein gecede sütuna bağlı iken kararlı kalabilir bir ara vermem için iyi bir yer olduğunu.</li>
	<li>Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) sistemi için sütun ekleyin ve protein arabelleği D 13 mL ile sütun (Tablo 3) ayırma ile elute. UV absorbans okuma göre protein zenginleştirilmiş kesirleri toplamak. Not: FPLC koşulları aşağıdaki gibidir: 1.0 mL kesir boyutu, bir ön sütun basınç alarm 0,3 MPa ve bir akış hızı 0.5 mL/dk için ayarlanmış.</li>
	<li>Microvolume spektrofotometre eluted protein ürün konsantrasyon ölçmek. 280 absorbans okumak nm.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) GFP-10xHis etiketi kaldırmak için 1:1 yığın oran TEV proteaz ekleyin ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Etiketi olabilir veya işlev veya saf kanal yapısını etkileyen değil. Birim ve adımları 3.7-3,8 toplanan protein konsantrasyonu TEV tutarı hesaplamak. Örneğin, elüsyon ürün 10 mL toplanan ve 0.1 mg/mL, toplam protein ölçülen kütlesi olduğunu TEV 10 x 0,1 = 1 mg ve 1 mg sindirim için kullanılacak.</li>
	<li>Protein (50 ya da 100 kDa) 15 mL santrifüj ile konsantre filtre birimi tarafından 4.000 x g 4 ° c (için FPLC bir 2 mL örnek yükleme döngü) 400-500 μL son hacmiyle de iplik. Not: Konsantrasyon için centrifuging zaman konsantrasyon ve protein büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Aşırı konsantre önlemek için hangi protein yağış neden olabilir, spin için ilk başta, 10 dk sonra kalan birim gözlemlemek ve tahmin bir sonraki tur time (Örneğin, 2-5 dk), ve benzeri, son hacim elde edilir. Damlalıklı filtre altına çekti protein dağıtmak için spin arasında.</li>
	<li>Yeni 1,5 mL tüp ve herhangi bir çökelti veya baloncuklar konsantre ürün kaldırmak için yoğun protein aktarın. At spin > 12.000 x g 5-10 dk 4 ° C ve süpernatant yeni 1,5 mL tüp içinde toplamak için.</li>
	<li>1 mL şırınga ve bir FPLC sistemde yuvarlak uçlu iğne niyetine boyutu-dışlama kromatografi ile nihai ürün ile tampon E (Tablo 5) önceden dengelenmiş boyutu-dışlama sütun yükleyin. Not: FPLC koşulları aşağıdaki gibidir: 0.5 mL kesir boyutu, bir ön sütun basınç alarm 2.50 MPa için ayarlanmış, bir akış birim arabelleği E 30 mL (Tablo 5), ve bir akış hızı 0.5 mL/dk için ayarlayın.</li>
	<li>Su kuyusu-davranmak proteinler bir tek uç aynı derecede (Şekil 2A) çalıştırmak ve toplamak için bu zirve (Şekil 2A) karşılık gelen protein fraction(s) dikkat edin.</li>
	<li>4 mL veya 0.5 mL santrifüj filtre birimi (aynı molekül ağırlığı kesme adım 3.10 olduğu gibi) ve 4000 x g 4 ° c 5-10 μg/μL son bir konsantrasyon ile spin ile protein konsantre. Spektrofotometre nihai ürün konsantrasyon (adım 3.8) denetlemek için kullanın. Not: nihai ürün birim arıtma denemeler arasında farklı olabilir Santrifüjü zaman, farklı olmadığı sürece. Genellikle, aralıklarla 10-20 dakika sürer. Bu filtre altına çekti protein dağıtmak için spin arasında damlalıklı önerilir.</li>
	<li>Yoğun protein yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Herhangi bir çökelti, centrifuging tarafından Kaldır > 12.000 x g 4 ° C'de 5-10 dk Süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. -80 ° C'de 10 μL aliquots muhafazası için yapın ve bir 4-%15 degrade SDS-sayfa jel 9 V/cm (Şekil 2B) çalıştırmak için bir 2-5 μL küçük aliquot kaydedin.</li>
	<li>Kütle spektrometresi8tarafından saf protein kimliğini onaylayın. Not: Vitro analiz fonksiyonu ve saf protein yapısını düzlemsel lipid bilayer ve x-ışını kristalografisi, sırasıyla5,8gerçekleştirilebilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+bestrophins:+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies.">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin,+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+a+novel+gene,+VMD2,+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best's+disease).">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li><li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy.">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1's+essential+role+in+mediating+Ca2+-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE.">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels.">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li><li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca(2+)-activated+Cl(-)+channel.">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li><li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels.">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li><li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bestrophin+1+and+retinal+disease.">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies.">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li><li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans.">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein,+bestrophin-1,+cause+retinitis+pigmentosa.">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li><li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+(Best+disease)+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration.">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li><li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+(ADVIRC).">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li><li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEST1:+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies.">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li><li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells.">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers.">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540 (2013).</li><li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2+-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A/16B+Ca2+-gated+Cl-+channels.">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li><li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2/CaV2.2+channels.">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).</li><li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels.">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li><li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rem,+a+member+of+the+RGK+GTPases,+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase.">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cryo-electron+microscopy+(cryo-EM)+and+cross-linking+mass+spectrometry+(CX-MS)+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies.">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li><li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders.">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı ifade ve gelecekteki vitro analizler için kullanılmak üzere memeli bestrophin iyon kanalları arınma için yararlı bir potansiyel açıklar. FPLC aygıt boyutu-dışlama kromatografi için gerekli olmakla birlikte, bir şırınga pompa benzeşme Kromatografi bağlama, yıkama ve eluting de dahil olmak üzere tüm adımları için yeterli olur. Bir şırınga pompa itme çözümlerinde (şırınga) üzerinden sütun için kullanırken, hava kabarcıkları sütuna iterek önlemek için ba...

Bestrophins iyon kanallarının bakterilerden insanlar1olarak değişen türler ile korunmuş bir aileyiz. İnsanlarda, BEST1 gen, kromozom 11q12.3 üzerinde bulunan membran proteini Bestrophin-1 (BEST1) ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) hücreleri gözleri2,3 demiri membran ifade edilen kodlar. ,4. 585 ilk ~ 350 olan türler arasında son derece korunmuş ve onun transmembran bölge içeren, aminoasitler, oluşan bir CaCC insanlar1,5,6BEST1 görür. Ayrıca, BEST1 homologs tavuklarda ve Klebsiella pneumoniae koruma evrim boyunca yüksek düzeyde düşündüren homopentamers7,8olarak, işlev.
İnsanlarda, 200'den fazla mutasyon BEST1 gen klinik olarak retina dejenerasyonu hastalıklarının bestrophinopathies1,9adlı bir gruba bağlıdır. En iyi hastalık, Yetişkin başlangıçlı vitelliform distrofi, otozomal dominant vitreoretinochoroidopathy, otozomal resesif bestrophinopathy ve retinitis pigmentosa3,4 de dahil olmak üzere beş belirli bestrophinopathies bildirilmiştir ,10,11,12,13,14. Azalan görme ve hatta körlüğe yol açar, bu hastalıkların Şu anda tedavi edilemez. Tedavi tedaviler ve potansiyel olarak Kişiselleştirilmiş tıp geliştirmek için nasıl bu BEST1 hastalığa neden olan mutasyonlar etkisi işlevi ve BEST1 kanal15yapısını anlamak için önemlidir. Bu amaçla, araştırmacılar saf bestrophin (yabani türü ve/veya mutant) kanalları sağlamanız ve vitro analizler5,8yapmak gerekir.
İlk önemli adım bestrophin kanalları memeli hücrelerinde yüksek türlerden ifadesidir. Baculovirus iletim (BacMam sistemi) HEK293-F hücrelerinin zar proteinleri16,17heterologously ifade etmek için güçlü bir yöntem olduğu için bu iletişim kuralı sağlam ifade için en iyi duruma getirilmiş bir BacMam vektörü (pEG BacMam) kullanır Bu durumda bir memeli bestrophin homolog olan hedef protein18. Bu vektör reseptörleri G protein birleştiğinde, nükleer reseptörleri ve diğer iyon kanalları18de dahil olmak üzere çeşitli membran proteinlerinin ifade için kullanılmıştır. Üretilen proteinlerin kristalografisi18için uygun olduğuna dair bir kanıt da vardır. İfade HEK293-F hücrelerdeki yüksek seviyeleri ile proteinler sonra Kromatografi kullanarak saf; Özellikle, bestrophins söz konusu olduğunda, benzeşme ve boyutu-dışlama Kromatografi kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı için bir bestrophin kanal ince ayarlı olduğunda, saf protein sonra onun fonksiyonu ve düzlemsel lipid bilayer ve x-ışını kristalografisi, sırasıyla5,8aracılığıyla yapısı için analiz edilebilir. Özet olarak, bu teknikleri bestrophins ve diğer iyon kanalları fonksiyonel ve yapısal incelemeler için güçlü bir boru hattı sağlar.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327265000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197530010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA4058704&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61188MB&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM sol-grade</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM anagrade</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>ThermoFisher</td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle medium</td><td>ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>High pressure homogenizer</td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap column</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex-200 column</td><td>GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-4 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-0.5 centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC505024</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN precast gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet transfection reagent</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>pEG BacMam vector</td><td></td><td></td><td>Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute</td></tr></tbody></table>

expression and purification of mammalian bestrophin ion channels

İnsan genomu dört bestrophin paralogs, yani BEST1, BEST2, BEST3 ve BEST4 kodlar. BEST1, BEST1 Gen tarafından kodlanmış olan bir Ca2 +-Cl- ağırlıklı olarak retina pigment epiteli (RPE) ifade kanal (CaCC) aktif. BEST1 fizyolojik ve patolojik önemi olduğunu BEST1 gen 200'den fazla farklı mutasyonların genetik olarak en az beş Retina dejeneratif bozuklukları, en iyi vitelliform gibi bir yelpazede bağlantılı olmuştur aslında tarafından vurgulanır yaşa bağlı makula distrofi (en iyi hastalığı). Bu nedenle, Biyofizik bestrophin kanal tek molekül düzeyinde anlamak çok büyük önemi tutar. Ancak, saflaştırılmış memeli iyon kanalları almak kez zor bir görev olduğunu. Burada, BacMam baculovirus Gen aktarım sistemi ve onların arıtma benzeşme ve boyutu-dışlama kromatografi ile memeli bestrophin proteinlerin ifade için bir protokol raporu. Saf protein sonraki fonksiyonel ve yapısal analizleri, lipid bilayers ve kristalografisi elektrofizyolojik kayıt gibi kullanılmak üzere potansiyeline sahiptir. Önemlisi, bu boru hattı fonksiyonlar ve diğer iyon kanal yapıları çalışmaya adapte edilebilir.

Geçici transfected yapışkanlı HEK293 hücrelerinde (Şekil 1A) Floresan yoğunluğu öngörülen protein ifade düzey süspansiyon HEK293-F hücrelerdeki (Şekil 1B) için iyi bir göstergedir. Hedef protein iyi ifade veya HEK293 hücrelerde sonra geçici transfection yanlış yerelleştirilmiştir değilse, bu ifade yapısı değiştirme göz önünde bulundurun için tavsiye edilir (Örn., GFP etiket konumunu deği...

Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels at JoVE.com

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.3K Görüntüleme.  University of Rochester, School of Medicine and Dentistry. İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

Video: Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe the application of this novel label-free technique to study the interaction of human EAG1 (hEAG1) channel proteins with the small molecule PIP2. hEAG1 channel has been recognized as potential therapeutic target because of its aberrant overexpression in cancers and a few gain-of-function mutations involved in some types of neurological diseases. We purified&#160;hEAG1 channel proteins from a mammalian stable expression system and measured the interaction with PIP2 by BLI. The successful measurement of the kinetics of binding between hEAG1 protein and PIP2 demonstrates that the BLI assay is a potential high-throughput approach used for novel small-molecule ligand screening in ion channel pharmacology.

The protocol here describes the interactions of purified hEAG1 ion channel protein with the small molecule lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2). The measurement demonstrates that BLI could be a potential method for novel small-molecule ion channel ligand screening.

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Biyokimya

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Biyomühendislik

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Biyoloji

Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcıların İfade Edilmesi ve Saflaştırılması için Stratejiler

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Yazar Spotlight: Kodon İçin Optimize Edilmiş Genler Kullanılarak İnsan Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcılarının İfadesi ve Saflaştırılması 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma