このプロトコルは、初代鼻上皮細胞を増幅、分化、および凍結保存するための重要なステップを強調しています。我々の培養条件では、初代鼻上皮細胞が肺上皮を模倣する。これにより、新鮮な細胞またはバイオバンク細胞からの患者由来の培養および個別化医療研究が可能になります。
患者由来の鼻上皮培養物は、CFTR活性を評価し、新しい治療法に対する患者の個々の応答を評価することによって嚢胞性線維症治療を支援するために使用することができる。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアであるAurelie Hattonです。開始するには、鼻上皮またはHNE細胞を、10ミリリットルの増幅培地中で増殖させる。
75平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコで摂氏37度と二酸化炭素5%で、80〜90%のコンフルエントに達するまでインキュベートする。培地を48~72時間ごとに交換してください。その後、10ミリリットルのマグネシウムおよびカルシウムを含まないDPBSで細胞を洗浄する。
生理食塩水を吸引して捨てる。2ミリリットルの0.25%トリプシンを加える前に、フラスコをインキュベーターに8〜12分間戻した。後で、細胞の剥離を助けるために手のひらでフラスコをしっかりと叩きます。
10ミリリットルの増幅培地を加え、酵素反応を停止させた。10ミリリットルのピペットを用いてフラスコを激しくすすぎ、フラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離し、細胞を15ミリリットルのチューブに集める。細胞懸濁液を500倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。
ペレットを5〜10ミリリットルの増幅培地に再懸濁する。その後、血球計数器で細胞を数えます。細胞計数後、細胞を摂氏4度で5分間、500倍Gで遠心分離し、上清を捨てる。
次いで、ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに入れて1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を3〜5回得た。マイナス80°Cの適切なクライオフリーズ容器内で、毎分約1°Cの温度を下げて細胞をゆっくりと凍結します。翌日、保存した試料を窒素保存容器に移し、長期保存する。
新しく調製した増幅培地を摂氏37度に設定した水浴中で温める。窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、クライオバイアルを水浴から取り出します。
バイアルを70%のアルコールで拭き取り、ボンネットの下に置きます。1ミリリットルのピペットを用いて、解凍した細胞を15ミリリットルのチューブに移す。次いで、1ミリリットルの温かい増幅媒体を滴下して加える。
1分後、さらに1ミリリットルの増幅培地を加え、1分間待ちます。10ミリリットルの増幅培地を加え、500倍Gで摂氏4度で2分間遠心分離する。上清を吸引して捨てる。
1ミリリットル当たり6個の細胞に対して10倍の細胞密度を達成するために必要な容量の増幅培地にペレットを再懸濁する。増幅培地を入れた25平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコに細胞を播種した後、細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。先に実証したように細胞増幅を行う前に、2〜3日間にわたって細胞増殖を目視で観察する。
0.33平方センチメートルのコラーゲンコーティング多孔質フィルター上に、フィルターあたり10〜5番目の細胞を3.3倍の密度で細胞を播種し、頂端側に300マイクロリットルの増幅培地、側底側に900マイクロリットルの空気液体培地を補充する。3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3~4週間、気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立する。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。
気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示した。78個のHNE細胞サンプルにおいて、フラッシング培地中での輸送の直後および1〜7日後に播種した鼻ブラッシングにおける成功率を比較した。成功した培養物の初期平均パーセンテージは82%であり、0〜5日間に播種されたサンプルでは87%に達した。
新鮮な条件下での分化に成功したサンプルの83%は、凍結保存されたサンプルでも成功しました。同様に、新鮮な条件下での鑑別に失敗したサンプルでは、71%が凍結融解条件下でも失敗しました。また、クライオバイアルあたり10~6個の細胞を2~3回の間で凍結したサンプルの50%は融解時に増殖に失敗し、6個の細胞に対して10~10個の2回以下では80%に達した。
DMSO処理HNE細胞におけるフォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化については、新鮮または凍結融解HNEの間に有意差は認められなかった。治療後、両方の細胞型は、フォルスコリンに応答した短絡電流変化の増加およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化の減少を伴う有意な補正を示した。CFTR機能二重療法の矯正応答は、DMSO処理されたHNE細胞と比較して、フォルスコリンに応答し、CFTR阻害剤172に応答して短絡電流変化がVX−809+VX−770、およびVX−661+VX−770の両方によって有意に改善されたと評価された。
6人のF508delホモ接合型患者からのHNEにおける3つの異なるCFTRモジュレーター療法が比較された。CFTR補正器とポテンショネータとを組み合わせて使用する場合、頂点およびCFTR変調器の両方を、フォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化を同程度に補正する。HNE細胞を凍結する場合、解凍時に良好な結果が得られる可能性を高めるためには、クライオバイアルあたり少なくとも300万個の細胞を有することが重要です。
HNE細胞におけるCFTR活性は、嚢胞性線維症における個別化療法を評価および調整するための良好な予測モデルであることが示されている。
