この方法は、クロマチン相互作用の役割など、転写調節分野の主要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、関心のある遺伝子座に対する相互作用の比較的公平なキャプチャを提供することです。この方法はプロモーターエンハンサー相互作用に関する洞察を提供することができるが、他のタイプのクロマチン相互作用を同定するために適用することもできる。
一般的に、この方法に新しい個人は、プロトコルのために数日かかるため苦労し、プライマーの設計には試行錯誤と非定型プライマーの向きが必要です。選択した細胞におけるクロマチン相互作用を維持するために、1000万個の細胞あたりPBSに1%電子顕微鏡グレードホルムアルデヒドの9.5ミリリットルを加えることによってそれらを架橋する。室温で10分間揺れながら細胞をインキュベートします。
反応管を氷に移してクロスリンク反応を消光し、氷冷1モルグリシンを最終濃度の0.125モルに加え、穏やかな反転によって混ぜます。テキストプロトコルに従って遠心分離して細胞を洗浄した後、0.5%SDSおよび1つのXプロテアーゼ阻害剤を用いて5ミリモルEDTAの125マイクロリットルのペレットを再び懸濁させる。氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。
細胞のlyseが完全であることを確認するために、顕微鏡スライド上のトリパンブルーの6マイクロリットルと細胞の6マイクロリットルを混合し、カバースリップで覆います。顕微鏡下で見て、細胞の内部を青色に見せ、未分解細胞を白く見る。最初の制限消化のために10 X制限酵素バッファーの30マイクロリットル、20%トリトンX-100の27マイクロリットルを細胞懸濁液に加え、水で300マイクロリットルに総容量を調節する。
15マイクロリットルのアリコートを取り除き、未消化のコントロールとして摂氏4度で保存します。残りの反応混合物に制限酵素1の200個のユニスを加える。900 RPM攪拌を伴う振度加熱ブロック内の酵素に適した温度で一晩インキュベートする。
翌日、酵素を200単位追加し、このインキュベーションを一晩継続します。15マイクロリットルのアリコートを取り除き、消化されたコントロールとして摂氏4度で保存します。消化効率を決定するために、10ミリモルトリス-HClの82.5マイクロリットル、pH 7.5を、各未消化および消化されたコントロールに加える。
2.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、65°Cで1時間インキュベートし、ホルムアルデヒドの架橋を逆にします。消化したDNAを分離するには、100マイクロリットルのフェノールクロロホルムをチューブに加えます。いくつかのクイック反転によって混合し、残存タンパク質汚染を除去します。
16で遠心分離機、100 Gは室温で5分間。遠心分離後、水相を新しいチューブに移します。酢酸ナトリウム、グリコーゲン、100%エタノールをチューブに加え、反転して軽く混ぜます。
DNAを沈殿させるために1時間マイナス80度でインキュベートする。チューブを16、100 Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を取り除き、500マイクロリットルの70%エタノールを加え、DNAペレットを洗浄します。
16で遠心分離機、100 Gは室温で5分間。上清空気を除去した後、ペレットを室温で2分間乾燥させて、残留エタノールを除去する。乾燥ペレットを50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再び懸濁し、テキストプロトコルに記載されているようにQPCRによる消化効率の決定に進みます。
ライゲーションの準備のため、65°Cでチューブを20分間インキュベートして制限酵素を加熱し活性化します。次いで、チューブの内容物を50ミリリットルの円錐管に移し、ヌクレアーゼを含まない水、10 Xリガーゼバッファー、およびT4 DNAリガーゼを加える。渦巻きで軽く混ぜ、摂氏16度で一晩インキュベートし、テキストプロトコルに記載されているように進みます。
逆交リンクするには、15マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートする。翌日、RNase Aを30マイクロリットル加え、摂氏37度で45分でインキュベートします。クロマチンの分離を続けるには、フェノールクロロホルムの7ミリリットルを追加し、いくつかの迅速な反転によって混合します。
室温で3,300Gでチューブを15分間遠心する。遠心分離後、水相を新しい50ミリリットルチューブに移し、ヌクレアーゼを含まない水、酢酸ナトリウム、グリコーゲン、および100%エタノールを3個加えます。内容物を混ぜ合わせ、マイナス80°Cで1時間インキュベートします。
インキュベーション後、チューブを摂氏4度で3、900Gで20分間遠心分離する。上清を取り出し、10ミリリットルの氷冷70%エタノールでペレットを洗います。摂氏4度で3、300Gの遠心分離機を15分間。
上清を取り出し、ペレットを室温で短時間乾燥させます。ペレットを摂氏37度で10ミリモルトリス-HCl pH 7.5の150マイクロリットルに溶解します。負の20°Cで保存するか、テキストプロトコルに記載されているように第二の制限消化、ライゲーション、およびDNA精製を継続します。
DNA精製後、逆PCRプライマーおよびサイバーおよびROX色素を用いてQPCRを行い、テキストに記載されているように未知の相互作用配列の逆PCR増幅のための増幅サイクルの数を決定する。シーケンシング用のDNAを調製するには、逆PCRの精製物の1マイクログラムと制限酵素モニターを消化して、第3の制限消化で餌配列を切り取ります。消化された制限酵素、またはREモニタを、予想される断片に適した濃度のアガロースゲル上で実行します。
ゲル電気泳動によって消化効率が決定されたら、テキストプロトコルに記載されているように、逆PCR産物の精製およびシーケンシングライブラリの調製を続けます。第3の制限消化は、円形染色体確認捕捉の次世代シーケンシングのためにこのプロトコルにおいて重要である。この消化は、クロマチンのアトラクションの同定を容易にすることができる餌配列をトリミングします。
消化されたREモニタのアガロースゲル電気泳動は、並列に消化された逆PCR産物の十分な消化を示した。4つのCシーケンシング読み取りを終了した後、BWAソフトウェアパッケージを使用して、ヒト参照ゲノムhg38にトリミングされ、マッピングされた。読み取りの大半は、ヒンディーIIIサイトに隣接する制限サイトHindiIIIまたはCviQ1Iサイトで期待通りに整列します。
この手順を試みている間、あなたの細胞が溶解し、クロマチンが十分に消化されていることを確認することが重要です。この手順に従って、クロマチン免疫沈殿またはCHIPのような他の方法は、クロマチン相互作用に関与する転写因子を同定するなどの追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、クロマチン分野の研究者が物理的な規制ネットワークを探索する道を開いた。
