遺伝子の正確な時空間的調節は、それらの間で相互作用する多様なシス調節要素によって制御される。我々のプロトコルは、プロモーター等の選択された遺伝子座のクロマチン接触を定量的に問い合わせることを可能にする。この技術により、さまざまな調節要素間の相互作用頻度を同時に特定し、定量化することができます。
胚体を生成するには、マウス胚性幹細胞を60%合流まで培養することから始める。次いで培養液を取り出し、滅菌したPBSを2ミリリットルで2回洗浄する。PBSを完全に取り出し、2ミリリットルの細胞剥離培地を加えます。
37°Cで培養料理をインキュベートします。5分間インキュベーションした後、8ミリリットルのEB分化培地を皿に加えます。mESCコロニーを解約して単細胞懸濁液を得るために、培地を上下15~20回ピペットし、懸濁液を10ミリリットルチューブに移した。
室温で5分間300回gの細胞を遠心分離する。その後、上清を慎重に除去します。細胞を計数した後、細胞ペレットをEB分化培地で再懸濁する。
15センチメートルの文化皿のふたを反転させます。200マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、ふたに20マイクロリットルの再懸濁液を堆積させる。蓋を慎重に反転し、培養皿の底部に置きます。
ぶら下がった滴で3日間インキュベートします。インキュベーション後に細胞を採取するには、10ミリリットルのPBSで蓋を軽く洗います。EBを含むPBSを50ミリリットルのプラスチックチューブに移します。
チューブを室温で30分間座らせた後、上清を慎重に取り除きます。EBはチューブの底に残されます。新鮮なEB分化培地の10ミリリットルでEBを穏やかに再中断します。
懸濁液を10センチメートルの細菌学的ペトリ皿に移します。3~6日後、逆顕微鏡を用い、EB形成を確認します。EJB は丸く、同質なサイズにする必要があります。
2つまたは3つの10センチメートルの皿から50ミリリットルのプラスチックチューブにEBを収集します。室温で5分間300倍gでエブを遠心分離します。上清を慎重に取り除き、10ミリリットルのPBSでEJBを再懸濁します。
再び室温で300倍gのエブを遠心分離し、今度は3分間。上清を取り除き、ペレットにトリプシン-EDTAを2ミリリットル加えます。15分間摂氏37度でチューブをインキュベートします。
インキュベーション中、ピペットは3分ごとに上下し、単一細胞懸濁液を得る。トリプシン反応を停止するには、8ミリリットルのEB分化培地を加える。新鮮なEB培地で細胞を再懸濁した後、パラホルムアルデヒドを1%の最終濃度に加え、回転下の室温で10分間細胞をインキュベートします。
0.125モルの最終濃度にグリシンを加えることによってホルムアルデヒドをクエンチする。原稿に記載されているように固定プロセスを完了し、液体窒素中の細胞ペレットをスナップフリーズします。作りたての氷冷のリシスバッファーに細胞ペレットを静かに再懸濁し、チューブを氷の上に置きます。
15分後、摂氏4度で5分間1,000倍gで細胞を遠心分離する。上清を捨て、500マイクロリットルの冷たいリシスバッファーでペレットを洗います。ペレットを0.5%SDSの50マイクロリットルの1.5ミリリットルのチューブに1xバッファ2で再懸濁し、チューブを摂氏62度の加熱ブロックに入れます。
10分後、加熱ブロックからチューブを取り出し、消化バッファーを追加します。過度の発泡を避け、ピペットでよく混ぜ、37°Cでチューブをインキュベートします。効率的な制限酵素消化を確実にするために、このプロトコルには、消化の反復ステップが含まれています。
そのため、消化バッファーの核を再中断することも重要です。さらに25マイクロリットルの消化バッファーを追加し、反転して混合し、未消化のコントロールとして8マイクロリットルを取ります。未消化のコントロールサンプルをマイナス20°Cで保存します。
次に、制限酵素Mbolのいくつかのアリコートを追加し、各アリコートの後に回転下で摂氏37度でインキュベートします。8マイクロリットルを消化された対照サンプルとして取る。両方のコントロールサンプルを逆リンクするには、10マイクロリットルのプロテイナーゼK.Incubateに80マイクロリットルのTEバッファーを摂氏65度で1時間追加します。
消化効率を確認するには、0.6%ゲルで20マイクロリットルのアリコートを実行します。正常な消化は、主に3.0〜5.0キロベースのペアの範囲の断片を示しています。原稿に記載されているように、剪断用のDNAを準備します。
超音波処理器を使用して、DNAを150〜700塩基対のサイズにせん断します。シアドDNAを通常の新しいセーフロックチューブに移し、同じサンプルから複数の超音波処理をプールします。温めたDNA精製ビーズを既存の体積の1.8倍の量で添加し、再懸濁して混ぜます。
5分間のインキュベーションの後、磁気ラックでビーズを回収します。チューブを磁気ラックに入れ、作りたての80%エタノールを1ミリリットルでビーズを2回洗います。ビーズを室温で2〜3分間空気乾燥させた後、ビーズを1x Trisバッファーに再懸濁してDNAを溶出させる。
吊り下げドロップ法を用いて、ESC分化誘導の6日後に同種のEB集団が得られた。ゲル電気泳動は、品質管理のためのプロトコル全体にわたって行った。Mbol による効率的な消化は、3 キロベースのペア未満のフラグメントになります。.
結紮後の電気泳動は、ほとんどの断片が3キロベース対より大きいことを示した。400から500塩基対の断片サイズは、超音波処理後に期待される。脱リン酸化およびシングルエンドアダプターのライゲーションの後、目的の標的を増幅するために2ラウンドのPCRを行った。
各ターゲットは、Pou5f1遺伝子座用のAとB、T遺伝子座のCとDの2つの異なるプライマー対で別々に増幅した。その結果、約400塩基対のDNAスミアが生まれた。あるいは、マルチプレックスPCRを実施して標的AとCを同時に増幅し、精製後に同様のフラグメントサイズを生じる。
これらの4Cプロファイルでは、水色のボックスは、分化中の動的変化を伴うエンハンサーの位置を示します。クロマチン領域は、EB分化中にPou5f1およびT遺伝子のプロモーターと接触する。POU5f1はEB分化中にダウンレギュレートされた。
逆に、TはEB分化中にアップレギュレートされた。効率的な制限酵素消化と交差ゲノムDNAの近接ライゲーションは、このプロトコルの成功を確実にするための重要な要因です。もう一つは、各軌跡の接触マップを尋問するプライマー設計です。
この手順は、標的の場所でクロマチン接触を尋問するのに理想的です。グローバルな変更が必要な場合は、Hi-C、プロモーターキャプチャHi-C、HiChIPなどのゲノム全体のアプローチを実行できます。
