このプロトコルは、低バックグラウンドシグナルで複数の長さスケールにわたる染色体折り畳みの特徴を正確に検出します。例えば、プロモーターエンハンサー相互作用は、染色体コンパートメントの文脈で分析することができる。制限エンドヌクレアーゼの使用は、投入材料の消化レベルの最適化を回避します。
ライゲーション産物を捕捉するためにゲル単離による選択は必要ありません。最も一般的な問題は、DSG固定後の細胞の喪失であり、高品質のライブラリを生成するのに十分なDNAを捕捉します。まず、5 x 10を含む150ミリメートルのプレートから6番目のセルまで真空トラップに結合されたパスツールピペットで培地を吸引します。
10ミリリットルのHBSSで細胞を2回洗浄します。細胞を架橋するには、23.125ミリリットルの1%ホルムアルデヒド溶液を15センチメートルのプレートに注ぎます。室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手でプレートを静かに揺らします。
次に、1.25ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、プレートを静かに回転させて架橋反応を消光してから、室温で5分間インキュベートします。氷上で15分間インキュベーションを続け、架橋を停止します。セルスクレーパーまたはゴム製の警官でプレートから細胞をこすり落とし、細胞懸濁液をピペット付きの50ミリリットルの円錐形チューブに移します。
懸濁液を室温で1, 000倍Gで10分間遠心分離し、吸引により上清を廃棄する。ペレットを10ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄します。その後、DSG架橋に進む前に再度遠心分離する。
DSGとの架橋のために、ペレット化された細胞を9.9ミリリットルのDPBSに再懸濁します。次に、100マイクロリットルの300ミリモルDSGを追加します。チューブを反転させて混合し、ローテーター上で室温で40分間細胞を架橋します。
架橋後、1.925ミリリットルの2.5モルグリシンを加え、転倒させて混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、細胞を2, 000倍Gで15分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの0.05%ウシ血清アルブミンDPBSに再懸濁してから、1.7ミリリットルのチューブに移します。細胞を摂氏4度で15分間2, 000倍Gで遠心分離し、上清を廃棄します。
ペレットを液体窒素でスナップ凍結してから、染色体確認キャプチャに進みます。架橋細胞アリコートを10マイクロリットルのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1ミリリットルの氷冷溶解バッファーに再懸濁し、Dounceホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。乳棒Aをゆっくりと上下に30回動かして細胞を均質化し、1分間インキュベートして細胞を冷ましてからさらに30ストロークします。
最後のストロークの後、ライセートを1.7ミリリットルのチューブに移します。溶解した懸濁液を2, 500倍Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、フリックまたはボルテックスして湿ったペレットを再懸濁します。
できるだけ多くの上清を取り除き、塊を最小限に抑えたヨーグルト様物質を得る。遠心分離前に、ペレットを500マイクロリットルの氷冷制限バッファーに再懸濁します。2回目の洗浄後、セルサイズに応じてペレットのキャリーオーバー量に約340マイクロリットルを加えた後、ピペッティングによりペレットを360マイクロリットルの制限バッファーに再懸濁します。
クロマチンの完全性をテストするために18マイクロリットルのライセートを確保するか、残りのライセート CI.To、38マイクロリットルの1%ドデシル硫酸ナトリウムをhi-Cチューブに加えて総容量380マイクロリットルを作り、気泡を導入せずにピペッティングで慎重に混合します。サンプルを摂氏65度で10分間振とうせずにインキュベートし、クロマチンを開きます。次に、すぐにチューブを氷の上に置きます。
Triton X-100で消化混合物を調製した後、この混合物を107マイクロリットルをhi-Cチューブに加えて総容量487マイクロリットルを作り、インターバル振とうしながらサーモミキサーで摂氏37度でクロマチンを一晩消化します。翌日、サンプルを摂氏65度に20分間移し、残りのエンドヌクレアーゼ活性を失活させます。サンプルを氷上に置いた後、10マイクロリットルの消化制御(DC)を取っておき、摂氏4度で保管します。
ピペットまたは回転させて蓋から結露を取り除きます。次に、58マイクロリットルのビオチンフィルインミックスを加えて、総容量を535マイクロリットルにします。泡を形成せずに穏やかにピペットしてから、サーモミキサーで摂氏23度で4時間インキュベートします。
インキュベーション後、665マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、サンプル量を1, 200マイクロリットルにします。ピペッティングでサンプルを混合し、サーモミキサーで摂氏16度で4時間インキュベートします。次に、2つの画分で50マイクロリットルのプロテイナーゼ-Kをhi-Cサンプルチューブに加え、インターバル振とうしながら摂氏65度で一晩インキュベートします。
DNA 精製のために、 100% 氷冷エタノールを加え、摂氏 4 度で 30 分間 18 、 000 倍の G でチューブを遠心分離します。非ペレット側から上清を完全に除去し、サンプルを10分間、またはペレットが目に見えて乾くまで風乾します。ペレットが乾いたら、ピペッティングまたは旋回によって450マイクロリットルのTris低EDTAに可溶化します。
可溶化した懸濁液を、分子量3キロダルトンのカットオフで0.5ミリメートル遠心フィルターユニット(CFU)に移します。CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。2回目の洗浄後、80マイクロリットルのTris低EDTAをカラムに加えます。
カラムを新しい収集チューブに変えて、最高速度で2分間遠心分離します。最後に、サンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。PCR滴定結果を含むアガロースゲルは、ほとんどのライブラリが5〜8サイクルの最終PCR増幅を必要とすることを示しました。
最終的な増幅PCRライブラリの細胞消化は、アガロースゲル上の小さなフラグメントによって観察され、適切なライゲーションジャンクションの存在を確認し、シーケンシング前の品質チェックとして機能します。シーケンシング後、マッピングされたデータは、DpnIIとDdeIの組み合わせが、従来のホルムアルデヒド架橋にDSGを追加するにつれて、短距離接触を有意に増加させることを示しました。改善された信号は、2D相互作用行列から直接長距離および短距離で観測することもできます。
コンパートメント信号は長距離ではCRISPRであり、クロマチンループによって形成されるドットは短距離でより顕著です。ホルムアルデヒドに加えて、DSGとの架橋はランダムライゲーションを減少させ、シスの相対被覆率を改善します。架橋中および架橋後に細胞を失わないことが重要です。
細胞ペレットは緩んでいたり見えなくなったりすることがあり、細胞は一部のバッファーのピペットチップに付着する可能性があります。
