이 방법은 크로마티안 상호 작용의 역할과 같은 전사 조절 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심의 궤적에 대한 상호 작용의 상대적으로 편견 캡처를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 프로모터 증강 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 다른 유형의 크로마틴 상호 작용을 식별하기 위해 적용 될 수도 있습니다.
일반적으로 이 메서드에 새로 사용되는 개인은 프로토콜에 대해 며칠이 걸리기 때문에 어려움을 겪고 있으며, 프라이머 설계에는 시행착오와 비정형 입문서 방향이 필요합니다. 선택의 세포에서 크로마틴 상호 작용을 보존하기 위해 1,000만 개의 세포당 PBS에 1%전자 현미경 등급 포름알데히드의 9.5 밀리리터를 추가하여 교차 연결합니다. 실온에서 10 분 동안 흔들면서 세포를 배양하십시오.
반응 튜브를 얼음으로 옮기면 교차 연결 반응을 담금질하고 얼음 차가운 1 개의 어어 글리신을 0.125 어금니의 최종 농도에 추가하고 부드러운 반전으로 혼합하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 원심 분리 및 세척한 후, 0.5%SDS와 1개의 X 프로테아제 억제제로 5밀리머 EDTA의 125마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 10 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양.
세포 리스가 완료되었는지 확인하려면 세포의 6 마이크로 리터와 현미경 슬라이드에 트라이팬 블루 6 마이크로 리터를 혼합하고 커버 슬립으로 덮습니다. 현미경으로 보면 용액 세포의 내부를 파란색으로 보고, 그리고 무언의 세포는 흰색으로 보입니다. 첫 번째 제한 소화를 위해 10X 제한 효소 완충제30마이크로리터와 20%트리톤 X-100의 27마이크로리터를 세포 현탁액에 추가하고 총 부피를 300 마이크로리터로 조절한다.
15 마이크로리터 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에 보관하여 소화되지 않은 컨트롤로 보관하십시오. 나머지 반응 혼합물에 200개의 제한 효소를 첨가한다. 900 RPM 교반을 가진 흔들리는 가열 블록에서 효소에 적합한 온도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
다음 날, 효소의 추가 200 단위를 추가하고 하룻밤이 배양을 계속. 15 마이크로리터 알리쿼트를 제거하고 섭씨 4도에 보관하여 소화 제어로 보관하십시오. 소화 효율을 결정하려면 소화되지 않고 소화되지 않은 각 컨트롤에 10 밀리머 트리스-HCl, pH 7.5의 82.5 마이크로리터를 추가합니다.
단백질Ae K의 2.5 마이크로 리터를 추가하고 포름 알데히드 크로스 연결을 반전하기 위해 섭씨 65도에서 1 시간 동안 배양. 소화된 DNA를 분리하려면 페놀 클로로폼 100마이크로리터를 튜브에 추가합니다. 잔류 단백질 오염을 제거하기 위해 몇 가지 빠른 반전으로 섞는다.
16, 100 G의 원심분리기는 실온에서 5분 동안 제공됩니다. 원심 분리 후 수성 단계를 새로운 튜브로 옮긴다. 아세테이트 나트륨, 글리코겐, 100% 에탄올을 튜브에 넣고 반전으로 부드럽게 섞습니다.
DNA를 침전시키기 위해 1 시간 동안 영하 80도에서 배양하십시오. 16, 100 G의 4도에서 20 분 동안 튜브원심분리하십시오. 상체를 제거한 다음 DNA 펠릿을 세척하기 위해 70%의 마이크로리터 500을 추가합니다.
16, 100 G의 원심분리기는 실온에서 5분 동안 제공됩니다. 상류 공기를 제거 한 후 잔류 에탄올을 제거하기 위해 2 분 동안 실온에서 펠릿을 건조시키십시오. 50 마이크로리터 뉴클레아제 프리 워터에서 말린 펠릿을 다시 중단하고 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 QPCR에 의한 소화 효율을 결정한다.
결찰을 준비하기 위해 65도에서 20분 동안 튜브를 배양하여 제한 효소를 가열하고 활성화합니다. 그런 다음 튜브의 내용을 50 밀리리터 원내 튜브로 전송하고 핵자유수, 10X 리게아제 완충제 및 T4 DNA 리갈아제를 첨가한다. 소용돌이에 의해 부드럽게 섞고, 하룻밤 사이에 섭씨 16도에서 배양하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진행합니다.
크로스 연결을 반대로하려면 단백질 AK의 15 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 65도에서 하룻밤 을 배양한다. 다음 날에는 RNase A의 마이크로리터 30기를 추가하고 섭씨 37도에서 45분만에 배양합니다. 크로마틴 절연을 계속하려면 페놀 클로로폼 7밀리리터를 추가하고 몇 가지 빠른 반전으로 섞습니다.
3, 300 G의 실내 온도에서 15 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 원심분리 후 수성 상을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮기고 핵아제 프리 워터, 3개의 어금니 나트륨 아세테이트, 글리코겐 및 100% 에탄올을 추가합니다. 내용내용을 혼합하고 1시간 동안 음수 섭씨 80도에서 배양합니다.
인큐베이션 후, 20 분 동안 섭씨 4도에서 3, 900 G의 원심 분리. 상체를 제거한 다음 펠릿을 얼음 냉기 70%에탄올 10밀리리터로 씻으십시오. 3, 300 G의 원심분리기는 섭씨 4도에서 15분 동안.
상체를 제거하고 실온에서 펠릿을 짧게 건조시다. 펠릿을 150 마이크로리터의 10 밀리머 트리-HCl pH 7.5에서 섭씨 37도에서 녹입니다. 음의 섭씨 20도에 저장하거나 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 두 번째 제한 소화, 결찰 및 DNA 정화를 계속합니다.
DNA 정화에 따라, 역 PCR 프라이머와 사이버 및 ROX 염료를 사용하여 QPCR을 수행하여 텍스트에 설명된 바와 같이 알 수 없는 상호 작용 서열의 반전 PCR 증폭을 위한 증폭 주기의 수를 결정한다. 시퀀싱을 위해 DNA를 준비하려면 역 PCR의 정제 된 제품의 마이크로그램과 제한 효소 모니터를 소화하여 세 번째 제한 소화로 미끼 서열을 다듬습니다. 소화된 제한 효소 또는 RE 모니터를 예상 된 단편에 적합한 농도의 아가로즈 젤에 실행합니다.
일단 소화 효율이 젤 전기포고에 의해 결정되면, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 역PCR 제품 정제 및 시퀀싱 라이브러리의 준비를 계속한다. 3차 제한 소화는 원형 염색체 확인 캡처의 차세대 시퀀싱을 위한 이 프로토콜에서 중요합니다. 이 소화는 크로마티안 어트랙션의 식별을 용이하게 할 수있는 미끼 시퀀스를 잘라.
소화된 RE 모니터의 아가로즈 겔 전기포고는 역PCR 제품의 소화를 병렬로 나타내었다. 완료 된 4 개의 C 시퀀싱 읽기는 BWA 소프트웨어 패키지를 사용하여 인간 참조 게놈 hg38에 손질및 매핑되었습니다. 읽기의 대부분은 예상대로 힌디어III 사이트에 인접한 제한 사이트 힌디어III 또는 CviQ1I 사이트에 정렬합니다.
이 절차를 시도하는 동안 세포가 lysed되고 염색체가 충분히 소화되는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 크로마티닌 면역 침전 또는 CHIP과 같은 다른 방법은 크로마틴 상호 작용에 관련된 전사 인자를 식별하는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다. 개발 후, 이 기술은 크로마틴 분야의 연구원들이 물리적 규제 네트워크를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
