本研究で使用される人間の腫瘍のサンプルは提供され、人間の研究地域の倫理ガイドラインに沿った商業ソースから取得しました。
1. サンプルは、機器、試薬等
<ol><li>
FFPE サンプルの準備
	<ol>
<li>組織<ol>
<li>常温 (RT) 16-32 h の中性緩衝ホルマリン 10% (NBF) の (厚さ 3-4 mm のブロックにカット) 組織を修正、解剖の直後します。 注: 固定時間は組織の種類とサイズによって異なります。</li>
			<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 サンプルを洗浄し、脱水の標準的なエタノール (エタノール) シリーズを使用して (70 %30-60 分、80% エタノール エタノール 90%、30-60 分間 30-60 分、95% のエタノール 30-60 分、3 x 100% エタノール エタノール 30-60 分) キシレンの順。</li>
			<li>標準的な手順6を使用してパラフィン サンプルを埋め込むし、余分なパラフィンを削除する必要に応じて、パラフィン ブロックをトリムします。 注: ブロック サイズ、組織サンプル サイズによって異なりますが、典型的なサイズは 0.75 0.75 インチ2 x またはより小さい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>セルライン<ol>
<li>収集し、特定のセルの行の推奨方法に従って細胞のペレットします。</li>
			<li>ローテーター上 24 時間常温 10% ホルムアルデヒドのセルを修復します。</li>
			<li>Prewarmed 処理ゲルでペレットとしてセルを準備 (e.g。、Histogel)。パラフィルムの部分にゲル細胞ペレットを氷の上に配置することによって固化するペレットをでき、2-3 分サブマージ 1x PBS でゲル細胞ペレットに座らせてください。</li>
			<li>脱水して、1.1.1 の手順で説明されているように細胞ペレットを埋め込みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>セクションの準備<ol>
<li>ミクロトームを使用して 5 ± 1 μ m のセクションに埋め込まれた組織/細胞を切り取り、静電接着ガラス スライド上のセクションをマウントおよび室温それらを一晩風乾 注: スライドは RT で 3 ヶ月間乾燥下で格納できます。</li>
			<li>スライド ラックのスライドを置くし、分析を実行する前に 60 ° C 1 時間で循環空気オーブンでマウントされた組織スライドを焼きます。 メモ: スライドを使用して、すぐに、1 週間の乾燥剤で常温保存します。長期の保管は RNA の劣化にあります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
機器の準備
	<ol>
<li>ハイブリダイゼーション オーブンを 40 ° C に設定します。徹底的にウェット加湿紙と湿度コントロール トレイに、残留 dH2O を挿入紙を削除、ハイブリダイゼーション オーブンを使用する前に、少なくとも 30 分間 prewarm トレイを挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
試薬の準備
	<ol>
<li>キシレンの 200 mL のエージェント料理をクリア 2 つを記入し、200 ml 100% の 2 つの染色料理を埋めるエタノールは、セクションの deparaffinization に使用されます。</li>
		<li>DH2O の 180 mL を 20 mL の 10 x ターゲット検索試薬に追加することで市販の 1 x ターゲット検索試薬の 200 mL を準備します。蒸し器で 2 つのスライド ホルダーを配置します。ターゲット検索試薬 × 1 の 200 mL の 1 つスライド ホルダーを記入し、船を使用して沸騰する両方のソリューション dH2o. 熱の 200 mL の他のスライド ホルダーを入力します。</li>
		<li>10-20 分準備 3 L の 60 mL を希釈して 1 x 洗浄バッファーの 40 ° c の暖かい 50 x 洗浄バッファー prewarmed dH2O. 2.94 l 50 x 洗浄バッファー</li>
		<li>発煙のフードではギルのヘマトキシリンの 100 mL を 100 mL の dH2o. に追加することによってソリューションを counterstaining 50% ギル ヘマトキシリンを準備します。ヒューム フードの準備ブルーイング試薬 (0.02% (w/v) アンモニア水) 28-30% 水酸化アンモニウムの 1.43 mL を 250 mL の dH2o. に追加することによって</li>
		<li>Prewarm プローブの交配前に 10 分の 40 ° C でターゲット プローブと増幅試薬 (AMP 0-6) をもたらす RT。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA In Situハイブリダイゼーション アッセイ
<ol><li>
Deparaffinization ・脱水
	<ol>
<li>1.1.3.2 の手順で説明されているように焼成後 (オプションの停止ポイント 1) 撹拌 5 分のキシレンのセクションを deparaffinize。再び新鮮なキシレン 100% で 5 分 Dehydrate deparaffinize 2 分攪拌、再び新鮮な 100% の繰り返しとエタノール エタノールを 2 分間。</li>
		<li>空気は循環空気オーブンで 60 ° C で 5 分間スライドを乾燥または RT までは完全に乾燥 (オプションの停止ポイント 2)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプル前処理
	<ol>
<li>内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチする RT で 10 分間の準備ができて使用する過酸化水素の 〜 4 滴とセクションを孵化させなさい。スライドからソリューションをデカントし、dH2o. で 2 回洗浄し</li>
		<li>蒸し器で 100 ° C で 15-30 分のためのターゲット検索試薬の 200 mL のセクションを孵化させなさい。 注: インキュベーション時間は組織の種類によって異なる場合があります。このプロトコルでは腫瘍のサンプルの細胞ペレット 15 分ターゲットの検索を行った。</li>
		<li>スライドからソリューションをデカント、dH2O 2 回すすぎ、ディップ 100% EtOH 3 分のドライ スライド循環空気オーブンで 60 ° C で、常温まで完全に乾燥します。</li>
		<li>約 0.75 x 0.75 インチ2疎水性のペンを使ってセクション囲む疎水性の障壁を描画します。 注: それは小さな障壁を描画するは推奨されません。大きいセクション、大きな障壁を描画する必要があります。</li>
		<li>1 分間完全に乾燥または室温で一晩を残すバリアができます (オプションの停止ポイント 3)。</li>
		<li>スライド ホルダーにスライドを置き、湿度コントロール トレイにスライド ホルダーを配置します。各スライドにプロテアーゼ III 〜 4 滴を追加し、タンパク質消化のため交配のオーブンに 40 ° C で 15-30 分間インキュベートそれら。 注: インキュベーション時間は組織の種類によって異なる場合があります。このプロトコルでは腫瘍サンプルの 30 分、細胞ペレットの 15 分のプロテアーゼ消化を行った。</li>
		<li>スライドからソリューションをデカントし、dH2o. で 2 回洗浄し</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プローブの交配
	<ol>
<li>セクション全体をカバーする適切なすぐに使用できるプローブ ソリューション 〜 4 滴を追加します。大きなセクションを使用して 〜 5-6 を追加しました。</li>
		<li>ハイブリダイゼーション オーブンで 40 ° C で 2 h のプローブを交配させます。スライドからソリューションをデカントし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。この手順では洗濯の手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
信号増幅
	<ol>
<li>アンプ 0 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンで 40 ° C でスライドごとの ~ 4 滴とセクションをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分の 1 の x 洗浄バッファーの 200 mL のスライドを洗ってください。この手順では洗濯の手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 1 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 15 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 2 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 3 〜 4 滴をセクションごとに 40 ° c 30 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 4 〜 4 滴とセクションごとに 40 ° c 15 分デカント ソリューション ハイブリダイゼーション オーブンでスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 5 〜 4 滴とセクションごとに 30 分デカント ソリューションの RT でスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
		<li>アンプ 6 〜 4 滴とセクションごとに 15 分デカント ソリューションの RT でスライドをインキュベートし、時折撹拌で RT で 2 分間洗浄バッファー x 1 の 200 mL のスライドを洗ってください。洗浄手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
信号検出
	<ol>
<li>作業ソリューション高速赤染料を準備します。高速の 120 μ L を高速赤 B 色素の 2 μ L を追加 0.75 x 0.75 インチ2障壁を 1 つのスライド、赤のチューブによく混ぜる。 メモ: 疎水性障壁とスライドの数のサイズに応じて高速赤作業ソリューションのボリュームが変動します。</li>
		<li>スライドから余分な液体をデカントし、スライドするソリューションを操作高速赤染料を追加します。光の露出を避けるためにカバーとトレイに RT で 10 分間のスライドを孵化させなさい。 メモ: 高速赤作業準備の 5 分内でソリューションを使用して、直射日光や紫外線にさらされないように。</li>
		<li>赤高速ソリューションをデカントし、水道水で 2 回スライドをすすいでください。スライド ラックにスライドを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining
	<ol>
<li>Counterstain した洗浄で 2 分間 50% ギル ヘマトキシリン液と組織切片を水道水スライドおよびスライドが明確なセクションは紫のままになるまでこれを数回繰り返します。ブルーイングの 0.02% アンモニア水にスライドをディップ (dip 2-3 回)。水道水とアンモニア水を交換し、3 ~ 5 回スライドを洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スライド マウント
	<ol>
<li>乾燥循環空気オーブン 15 分の 60 ° c または完全になるまで常温でスライドを乾燥します。各セクションの上各スライドと場所 coverslips に取り付け試薬を 1-2 滴を配置します。空気の泡のすべてのトラップを避けてください。空気は、少なくとも 5 分のスライドを乾燥させます。 注: 高速赤基板はアルコール依存です。アルコールでスライドを行うステータス退避を行いません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
可視化
	<ol>
<li>標準的な明視野顕微鏡スライドを観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paraffin processing of tissue. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+MET+via+diverse+exon+14+splicing+alterations+occurs+in+multiple+tumor+types+and+confers+clinical+sensitivity+to+MET+inhibitors.">Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.</a> Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).</li><li>Awad, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+Exon+14+Mutations+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+Are+Associated+With+Advanced+Age+and+Stage-Dependent+MET+Genomic+Amplification+and+c-Met+Overexpression.">MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer.">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).</li><li>Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Baker, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+RNA-based+in+situ+mutation+detection+delineates+colorectal+cancer+subclonal+evolution.">Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution.</a> Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).</li></ol>

すべての著者は、高度な細胞診断株式会社によって採用されて

このレポートで詳しく小説っぽいの試金のプロトコルとその応用を論じた。アッセイは、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および組織のコンテキストにおける点変異の直接可視化が可能です。アッセイは、RNAscope 技術5に基づいており、したがって単一分子検出が可能です。ただし、高度な増幅方式により信号を検出プローブとしてはほとんど 1 つのダブル Z のペアを含む、ちょうど 50 のヌクレオチドのターゲット テンプレートの長さできます。プローブ長さシングル ダブル Z として短いことがあるのでこれにより、エキソン接合、短期目標と高い相同性シーケンス、および点突然変異 (表 1) の検出のため。
アッセイの成功したパフォーマンスのいくつかの技術的な推奨事項があります。まず、組織は、室温 16-32 h10新鮮な 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) で修正されるはず。Underfixation (< 16 h) または overfixation (> 32 h) アッセイのパフォーマンスが低下し、さらなる最適化が必要な場合があります。第二が堅牢なプローブの交配および信号の増幅に必要な温度と湿度、最適にコントロールする処理システム、ハイブリダイゼーション オーブン スライドに使用するプロトコルの手順 5 に 2.3 (プロテアーゼ前処理、プローブ交配、信号増幅、および信号検出)。第三に、過剰な残留バッファーは、プロトコルを通して各ステップの前に正しくデカントし (しかしないなので、組織切片が乾く) にする必要があります。スライドが乾く場合重要な非固有の信号を開発します。第四に、組織の種類に応じて、前処理の最適化は必要かもしれません。間違ってプロテアーゼを使用してまたは時間の最適な長さの実行可能性の下で- またはオーバー-digestion と信号に悪影響を及ぼします。最後に、常にテスト プローブで正と負のコントロールを実行することが重要です。陰性コントロール プローブには、サンプルの RNA の品質はプローブのテスト結果を解釈するために最適であると、バック グラウンド信号がないポジティブ コントロール プローブは、測定が正しく行われていることを確認を確認します。信号がないポジティブ コントロール プローブと、サンプルの RNA の品質が最適ではない場合、テスト プローブを信号が表示されません。
手動測定に加えて自動方向づけるでアッセイを行う機能はまた実証 (図 6) であります。この自動っぽい試金高い信号対雑音比が得られ表 1で示すように、同様のアプリケーションに適用可能なただし、自動化されたアッセイの利点はアッセイ条件, ユーザ間の変動性と実践的な時間の最小化の標準化、信頼性の高い方法で組織サンプルの高スループット スクリーニングのための手当します。
免疫組織染色 (IHC) および qRT PCR FFPE 臨床検体におけるスプライス変異 (特に EGFRvIII) の検出を可能にする、これらのテクニック不足することは必要な特異性、スプライスの空間分解能への洞察力を提供していません。バリアント型の式は、それぞれ11,12。このプロトコルのアッセイの主な利点はその高感度・特定の可視化スプライス接合形態の組織コンテキストを維持しながら。ここでは、EGFRvIII と METΔ14 を含むいくつかのスプライスバリアントのユニークなエキソン接合を正確にターゲットにアッセイの能力が実証 (図 3 および 6)。さらに、前立腺癌、脳で ErbB4 の複数のアイソ フォームとマウス脳3,13,14の円形の RNA Cdr1as のノックアウトの確認のスプライスバリアント AR V7 を検出するアッセイを示されています。
Jurkat 細胞 (図 3) 由来 CDR3 シーケンスの検出によって示されているようにこの ISH 法による短いターゲット シーケンスの検出できます限り短く、長さ 50 のヌクレオチド RNA シーケンスの可視化。アッセイは、Revêchonらが示すように、他の家族のメンバーまたは種と高い相同性は遺伝子の塩基配列を検出することも。、マウス皮下白色脂肪15で表される人間の progerin を検出する短いターゲット試金を使用しました。さらに、小さな核小体 RNA (snoRNA)、CRISPR 媒介性遺伝子の編集、および前駆体マイクロ Rna 検出されたその場で短いターゲット分析をすることができます。最近では、Fu et al.は、プレ-マイクロ Rna mir125b16を表現する網膜の精密な細胞を識別するために IHC とこのっぽいアッセイを組み合わせます。
腫瘍におけるプロファイリングの突然変異は腫瘍の進行を勉強するため、目標とされた療法を開発するために重要です。変異プロファイルは、高スループット シーケンスを介して達成することができます、一方この技術は腫瘍細胞形態17,18の不均一性やリンクの遺伝子変異を十分に対応できません。このっぽいアッセイを用いた点突然変異の検出は、単一ベース解像度、細胞 (図 5) の EGFR L858R KRAS G12A 単一のヌクレオチド変化の検出による検証として RNA ターゲット シーケンスの区別のためことができます。さらに、ベイカーらは、大腸癌18PIK3CA、KRAS, BRAF 遺伝子に複数の変異を対象とするのに点突然変異の試金を使用しました。識別し、最終的に内腫瘍の多様性に貢献する方法を示す腫瘍細胞のまれな変異サブクローンを空間的にマッピングすることができました。
要約すると、特殊な RNA っぽいアッセイを開発しました。この手法は、スプライスバリアント、短いシーケンス、およびその場で突然変異の検出のためことができます。マニュアルの方法と自動方向づけるの両方のパフォーマンスに敏感な特定、定量化、および適応です。

マイクロ アレイや次世代の RNA シーケンス (RNAseq) などの高スループット トランスクリプトーム技術は指数関数的になど様々 な疾患の診断、予後、および予測の臨床的価値を持つ RNA バイオ マーカーの発見を改善しています。がん1,2。精密医学におけるこれらのバイオ マーカーの使用を事前には、高い臨床サンプルの組織コンテキスト内で RNA バイオ マーカーを測定することができます標準で堅牢な技術の必要性。必要な組織の均質化と RNA の隔離が体内細胞型特異性の損失を意味しながら広く確立される RNAseq など定量的 RT-PCR を挽くとバインド アッセイは、高感度遺伝子発現測定を有効にすると、形態素情報3。感度と特異度の組織コンテキスト4内希少または低発現 RNA バイオ マーカーを確実に測定するために必要な従来の in situ RNA 検出の方法論を欠いています。
商業の in situハイブリダイゼーション (っぽい) アッセイ (e.g、RNAscope 試金) はこれらに取り組んできた 1 つの技術課題とも 300 を超える単一の RNA 分子の高感度・特定の可視化を実現。組織形態学的文脈の中でのヌクレオチド。このタイプの試金は、約 6-20 ダブル Z プローブ ペア交配ベースの高度な信号増幅5と組み合わせてのユニークなオリゴヌクレオチド プローブ デザインを使用しています。
本研究では、特殊な RNA っぽい試金、BaseScope、50 のヌクレオチド塩基の分解能で短い RNA ターゲット シーケンスを検出する以前にデザインされた商業技術を補完するものをについて説明します。この試金はトランスクリプトームの複雑な複雑さに対処、エキソン接合、短いターゲット シーケンス、およびわずか 1 ダブル Z プローブ ペアを使用して、組織コンテキスト (表 1) に点突然変異の正確な検出を適用されます。FFPE の単一塩基配列変異細胞ラインおよび腫瘍組織とこのレポートは完全な試金のプロトコル、スプライスバリアント、T 細胞受容体クローンの CDR3 シーケンスの検出での使用を示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

精密医学はバイオ マーカーの検出に依存、ので RNA バイオ マーカー測定現場で臨床検体で標準化された、堅牢なテクノロジが必要になってあります。挽くとバインドの試金のように RNAseq、定量的 RT-PCR 高感度遺伝子発現測定を有効にする、彼らはまた RNA の抽出を必要とする、形態の組織コンテキスト内で貴重な発現解析を防ぐため。ここで説明したその場で交配 (っぽい) のアッセイは、50 のヌクレオチド塩基の分解能で、単一セルのレベルの短い RNA ターゲット シーケンスを検出できます。この試金は開発済みの商業分析を補完するもの、スプライスバリアント、短いターゲット、および組織内の点突然変異の高感度および特定の in situ検出。このプロトコルでは、プローブは、EGFRvIII と METΔ14 2 つの臨床的に重要なスプライスバリアントのユニークなエキソン接合をターゲットに設計されていた。短いターゲット シーケンスの検出は、T 細胞受容体 α および Jurkat T 細胞株における β の CDR3 シーケンスの特定の検出によって示されました。また、細胞を用いた自動染色の EGFR L858R KRAS G12A 単一ヌクレオチド変化の可視化による単一ヌクレオチド分解能 (点突然変異) RNA ターゲット シーケンスの区別のためこのっぽいアッセイの有用性プラットフォーム。要約すると、プロトコルは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および突然変異の in situ手動によるパフォーマンスと自動方向づけるの検出を可能にする特殊な RNA っぽい試金を示しています。

その場で交配分析ワークフロー: ワークフロー図 1に描かれている、4 つの部分で構成されています: セルまたはターゲット検索とプロテアーゼ、ソリューションのターゲット RNA プローブの交配組織の透過信号増幅、および信号の可視化。信号は、デジタル イメージング ソフトウェア システムを使用して定量化することができますまたはセルごとのドット数に基づく半定量的な方法で。図 2に記載されている手動の手順も完全に商用自動染色システムで自動化されています。
代表的な染色のエキソン接合検出 (EGFRvIII スプライスバリアント): EGFRvIII はエクソン 2 に 7 のフレームでゲノム削除から発生する上皮成長因子受容体の変異恒常活性がん化シグナル7 につながる.アッセイは、EGFRvIII FFPE 膠芽腫 (GBM) 腫瘍サンプルの状態を識別するために使用されました。シングル ダブル Z プローブがいずれかの重量を検出するためにエキソン接合にまたがるように設計された突然変異体、または両方の成績証明書 (図 3 a)。WT EGFR プローブ EGFRvIII プローブ エクソン 1 と 8 (E1/E8) の接合部にまたがる、エクソン 1 と 2 (E1 ・ E2) またはエクソン 7 および 8 (E7 ・ E8) の接合部に します。エクソン 8 および 9 (E8 ・ E9) の接合部にまたがる一般的なプローブも合計 EGFR (WT、EGFRvIII 成績証明書) を検出するために使われました。すべてのプローブは、GBM FFPE サンプルの EGFR の状態を確認する使用してしました。図 3Bに示すように 2 つの代表的な例は、大規模な研究から撮影されました。独立した法、RT-PCR 法による EGFR ステータスを確認しました。両方の WT のプローブでは、両方のサンプルを示す 2 つのサンプルが (図 3 b) WT EGFR を表現で信号が検出されました。ただし、変異のプローブだけ EGFRvIII + サンプルは、このサンプルは確かに EGFRvIII バリアント (図 3 b、左パネル) の肯定的な確認の信号検出を示した。逆に、突然変異体のプローブは、EGFRvIII サンプル (図 3 b、右側のパネル) で信号を検出しませんでした。一緒に取られて、これらの結果は、エクソン結合アッセイが GBM FFPE 腫瘍サンプルの EGFRvIII ステータスを識別できることを示します。
短期目標のために汚れる代表: CDR3、または補完決定地域 3 は、T 細胞受容体に非常に可変ドメインです。通常、CDR3 シーケンスは非常に短い;たとえば、Jurkat T セルラインから CDR3 の α と β のシーケンスは、それぞれ長さ 51 および 48 のヌクレオチド (図 4 a)。Jurkat 細胞、CDR3 のアンチセンス プローブで表される特定の CDR シーケンスを識別する α と β Jurkat T 細胞に表現される生成された、CDR3 の意味プローブに加えて α と β として負の制御プローブします。すべてのプローブは FFPE 準備 Jurkat 細胞アッセイで、調べた。堅牢な染色が観察された両方 CDR3 のアンチセンス プローブと α と β Jurkat 細胞感覚プローブに対し信号が検出された小さながありません (図 4 b)。これらの結果は、T 細胞受容体クローンの CDR シーケンスを非常に変数が、短い間に識別する短いターゲット分析の能力を発揮します。
点突然変異 EGFR L858R 染色代表: 点突然変異のプローブは、腫瘍のコンテキストで単一のヌクレオチドの変化と小さな挿入または削除 (オクターリピート) を検出するため開発されました。図 5 aは、点変異 EGFR L858Rの in situ検出能力を発揮 (2573T > G)。2 つのプローブを設計されていた: 1 つは、L858R を検出する変異 EGFR シーケンス、および別の EGFR L858 WT シーケンスを検出します。2 つの FFPE 準備セルラインで両方のプローブでテストした: H2229、EGFR L858 WT; のみを表現します。H1975、EGFR L858R 変異のヘテロ接合体であります。H2229 細胞株ではなく H1975 セルラインでのみ、L858R 変異プローブに信号が検出されました。しかし、WT プローブ両方の細胞に信号が検出されました。同様に、その場でKRAS G12A 点突然変異の検出を可視化図 5B (35 G > C)。2 つのプローブは、KRAS G12A MT と KRAS G12 WT シーケンスを検出するように設計され、HuT78 細胞株 (KRA G12 WT を表現のみ) して (G12A KRAS 変異のヘテロ接合体である) SW116 細胞ラインをテストされ。KRAS G12 WT プローブでは、両方の細胞に信号が検出された、KRA G12A プローブでは、SW116 細胞における信号のみ検出。一緒に取られて、これらのデータは、細胞・組織における一塩基多型の検出に点突然変異の試金の技術力を示しています。
染色自動その場で試金のための代表: 自動アッセイを確実に実行するサンプルの大きい数のため許可するユーザ間変動とハンズオン時間を最小限に抑え、一貫して再現可能な結果を生成します。したがって、アッセイの自動化された版は開発されました。このアッセイで自動染色を示す、スプライスバリアント METΔ14 の検出について検討しました。このバリアントは、mRNA スプライシング、構成的活性化と MET 受容体8,9の発癌につながる時にスキップされる MET 遺伝子のエクソン 14 の結果です。METΔ14 バリアントを特に検出するため 2 つのエキソン接合プローブを設計されていた: エクソン 13 と 15 (E13/E15) METΔ14 バリアント トラン スクリプトを検出するための接合部にまたがる、もう一方はエクソン 14 および 15 (E14/E15) WT 会ったを検出するための接合部にまたがるトラン スクリプト (図 6 a)。2 の FFPE 準備セルラインでテストされ、両方のプローブ: H596 METΔ14 バリアントを表わす、A549 WT に会った遺伝子を表現します。両方のプローブは、のみ H596 細胞でのみ A549 細胞 (図 6 b ・ 6 C) 信号を検出 E14/E15 プローブ信号を検出 E13/E15 プローブと相互に排他的な発現パターンを示した。最後に、dapB 用プローブは、バック グラウンド信号 (図 6 b ・ 6 C) がないことを示す信号を示さなかった。全体的にみて、このデータは、MET バリアント METΔ14 の場で自動 BaseScope アッセイを利用した特異的検出を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> 図 1: 分析ワークフロー 。ワークフローは、4 つの主要なステップで構成されています: 細胞または組織、ターゲット RNA プローブの交配を permeabilize 前処理信号の増幅と明視野観察や蛍光顕微鏡下で可視化による信号検出します。個々 のドットは、デジタル画像解析プラットフォームを使用して定量化することができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> 図 2: 手動の試金のプロトコルのイラスト。9 回は組織の種類によって異なる場合がありますので、インキュベーション時間に関する組織前処理推奨のユーザー マニュアルの付録 A を参照してくださいお勧め前処理における全体の分析を完了ことができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> 図 3: エキソン接合検出の代表的なイメージです。(A) 表示ここでは、エクソン EGFR WT、EGFRvIII コピー EGFR WT や EGFRvIII を検出するジャンクションを跨ぐダブル Z エキソン接合プローブを描いた模式図機構。(B)、エクソン結合アッセイは、ポジティブ コントロール プローブ、POLR2A、および陰性コントロール プローブ、dapB だけでなく、(A) に記載されているプローブを用いた 2 つの FFPE 膠芽腫のサンプルで実行されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> 図 4: 短いターゲットの代表的なイメージ シーケンス検出します。(A) 表示ここが Jurkat 細胞 CDR3 シーケンス。黒でシーケンスが並ぶ一般的なシーケンス、赤のシーケンスは CDR3α または CDR3β のいずれかに一意です。シングル ダブル Z 短いターゲット シーケンスのプローブは、これらのシーケンスに対して設計されていた。Jurkat 細胞 (a) シーケンスをターゲット反感覚または感覚のプローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備 (B) 短いターゲット分析を行い dapB ネガティブ コントロールとして使用されていた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> 図 5: 点突然変異検出の代表的なイメージです。(A) アッセイを行った H2229 細胞 (egfr 遺伝子 L858 のホモ接合体) と H1975 (EGFR L858R 変異 heterozygous) EGFR L858 WT シーケンスまたは EGFR L858R 対象シングル ダブル Z 点突然変異プローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備変異のシーケンス。(B) 点突然変異の試金は HuT78 細胞 (KRA G12A のホモ接合体) と SW116 (G12A KRAS 変異 heterozygous) KRA G12 WT シーケンスをターゲット シングル ダブル Z 点突然変異プローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備に行ったかG12A KRAS 変異シーケンスです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> 図 6: エクソン結合アッセイの自動化された染色の代表的なイメージです。(A) 表示ここで会った WT と METΔ14 の成績証明書と会った WT や METΔ14 を検出するジャンクションを跨ぐシングル ダブル Z エキソン接合プローブを描いた模式図のためのエクソン組織であります。(B) 陰性コントロール プローブ dapB だけでなく、H596 細胞 (METΔ14) の (A) に記載されているプローブを用いた FFPE 細胞ペレットとして準備 (会った WT を発現する) A549 細胞 (C) 自動化されたエクソン結合アッセイを行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>エキソンジャンクション</td>
			<td>短いシーケンス</td>
			<td>点変異</td>
		</tr>
<tr>
<td>スプライスの変形/アイソ フォーム</td>
			<td>50 と 300 nt 間のシーケンス</td>
			<td>点変異</td>
		</tr>
<tr>
<td>円形 RNA (circRNA)</td>
			<td>高度の相同</td>
			<td>短い塩基</td>
		</tr>
<tr>
<td>遺伝子融合</td>
			<td>TCR クローン CDR3 シーケンス</td>
			<td>遺伝子の編集</td>
		</tr>
<tr>
<td>遺伝子ノックアウト (KO)</td>
			<td>プレ-マイクロ Rna</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>小さな核小体 RNA (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>遺伝子の編集</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: のアプリケーション、その場でアッセイ。本法の適用のための 3 つの主なカテゴリー: エキソンジャンクション、短いターゲット シーケンス、および点突然変異。各列に記載されている各カテゴリのいくつかの特定のアプリケーションの例です。

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Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション アッセイについて述べる。手動でまたは自動的に実行できます、アッセイは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および組織のコンテキスト内での突然変異の可視化を有効にできます。

遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

10.5K ビュー.  Advanced Cell Diagnostics, Inc. ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション アッセイについて述べる。手動でまたは自動的に実行できます、アッセイは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および組織のコンテキスト内での突然変異の可視化を有効?...

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

可視化RNAの局在にアフリカツメガエル卵母細胞

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

生殖障害を持つヒトで同定されたGC -リッチなKISS1受容体配列の遺伝的変異の変異導入と解析

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

放射性その場で</em組織における多様な遺伝子発現パターンを検出するための>ハイブリダイゼーション

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...