Las muestras de tumores humanos utilizadas en este estudio fueron deidentified y adquiridas de fuentes comerciales con arreglo a las normas éticas locales para la investigación en humanos.
1. muestra, equipo y preparación de los reactivos
<ol><li>
Preparación de la muestra FFPE
	<ol>
<li>Tejidos<ol>
<li>Inmediatamente después de la disección, fijar el tejido (cortado en bloques de 3 – 4 mm de espesor) en tampón neutro formalina al 10% (NBF) de 16-32 h a temperatura ambiente (RT). Nota: Tiempo de fijación varía dependiendo del tamaño y tipo de tejido.</li>
			<li>Lavar la muestra con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y deshidratar mediante una serie estándar de etanol (EtOH) (70% EtOH durante 30 – 60 min, 80% EtOH durante 30-60 min., 90% EtOH durante 30 – 60 min, 95% EtOH durante 30 – 60 min, 3 x 100% de EtOH 30-60 min) seguido de xileno.</li>
			<li>Embeber la muestra en parafina utilizando procedimientos estándar6 y cortar los bloques de parafina según sea necesario para eliminar la parafina sobrante. Nota: Tamaño de bloque variará dependiendo del tamaño de la muestra de tejido, pero un tamaño típico es de 0.75 x 0.75 pulgadas2 o más pequeño.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Líneas celulares<ol>
<li>Recoger y pelotilla células según los métodos recomendados para la línea celular específica.</li>
			<li>Fijar las células en formol 10% a temperatura ambiente por 24 h en un rotador.</li>
			<li>Preparar las células como una pelotilla en gel procesamiento de precalentado (por ej., Histogel). Permite la pelotilla a solidificar colocando el precipitado de células de gel en un trozo de parafilm en hielo y dejar reposar 2-3 min sumerja el precipitado de células de gel en PBS 1 x.</li>
			<li>Deshidratar e incrustar los pellets de células como se describe en el paso 1.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sección Preparación<ol>
<li>Cortar las células del tejido/incrustadas en 5 secciones de 1 μm ± usando un micrótomo, Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio adhesivo electrostático y les deje secar al aire durante la noche a TA. Nota: Las diapositivas pueden almacenarse a temperatura ambiente bajo desecación hasta 3 meses.</li>
			<li>Colocar los portaobjetos en una parrilla y hornee los portaobjetos de tejido montado en un horno de aire circulante a 60 ° C por 1 h antes de realizar el ensayo. Nota: Utilice las diapositivas inmediatamente o almacenar a temperatura ambiente con desecantes hasta 1 semana. Un almacenamiento prolongado puede resultar en la degradación del RNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de equipo
	<ol>
<li>Programar el horno de hibridación a 40 ° C. Completamente moje el papel humidificación quitar cualquier residual de dH2O. Inserte el papel en la bandeja de control de humedad e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación se precaliente durante al menos 30 minutos antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación del reactivo
	<ol>
<li>Llenar dos claro platos agente con 200 mL de xileno y llenar dos platos tinción con 200 mL de 100% EtOH, que se utilizará para parafina secciones.</li>
		<li>Preparar 200 mL de reactivo de recuperación 1 x disponible en el mercado objetivo mediante la adición de 180 mL de dH2O 20 ml de reactivo de recuperación de destino de x 10. Colocar dos soportes de diapositivas en un vapor. Llenar un sostenedor de la diapositiva con 200 mL de 1 x reactivo de recuperación de destino y llenar el otro soporte de diapositiva con 200 mL de dH2calor o ambas soluciones a hervir con el vapor.</li>
		<li>Precalentado de tampón de lavado x 50 caliente a 40 ° C durante 10-20 minutos preparar 3 L 1 x de tampón de lavado diluyendo 60 mL de tampón de lavado x 50 con 2,94 L de dH2O.</li>
		<li>En una campana de humos, preparar hematoxilina de Gill 50% solución de contratinción añadiendo 100 mL de hematoxilina de Gill y 100 mL de dH2O. En la capilla del humo, preparar el reactivo de azulado (agua de amoníaco 0,02% (p/v)) agregando 1,43 mL de hidróxido de amonio 28-30% a 250 mL de dH2O.</li>
		<li>Precaliente sondas blanco a 40 ° C durante 10 minutos antes de la hibridación de la sonda y traer los reactivos de amplificación (AMP 0-6) a RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ARN In Situ ensayo de hibridación
<ol><li>
Parafina y deshidratación
	<ol>
<li>Después de la cocción tal como se describe en el paso 1.1.3.2 (opcional punto 1), Desparafinizar las secciones en xileno durante 5 minutos con agitación. Desparafinizar otra vez en xileno fresco por 5 min deshidratar en 100% EtOH por 2 min con agitación y repita otra vez en fresco 100% EtOH por 2 min.</li>
		<li>Aire seco el portaobjetos durante 5 minutos a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta que estén completamente secos (parada opcional punto 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pretratamientos de la muestra
	<ol>
<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de peróxido de hidrógeno listo para su uso por 10 min a temperatura ambiente para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH2O.</li>
		<li>Incubar las secciones con 200 mL del reactivo de recuperación objetivo para 15-30 min a 100 ° C en un vapor. Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, recuperación del destino se realizó durante 15 min para muestras tumorales y gránulos de la célula.</li>
		<li>Decantar la solución de las diapositivas, enjuagar dos veces con dH2O, la inmersión en un 100% EtOH por 3 minutos y seca las diapositivas a 60 ° C en un horno de aire circulante o a temperatura ambiente hasta totalmente seco.</li>
		<li>Dibujar una barrera hidrofóbica alrededor de la sección utilizando un lápiz hidrofóbico, aproximadamente 0.75 x 0.75 pulgadas2. Nota: No se recomienda establecer una barrera más pequeña. Para secciones más grandes, una barrera más grande tendrá que ser dibujado.</li>
		<li>Deje que la barrera secar completamente durante 1 min, o dejar toda la noche a temperatura ambiente (punto opcional 3).</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en un porta diapositivas y coloque el soporte de la diapositiva en la bandeja de control de humedad. Añadir ~ 4 gotas de proteasa III a cada diapositiva e Incube por 15-30 min a 40 ° C en el horno de hibridación para la digestión de proteínas. Nota: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tipo de tejido. En este protocolo, digestión de proteasa fue realizada por 30 minutos para las muestras del tumor y 15 min para las pelotillas de la célula.</li>
		<li>Decantar la solución de las correderas y enjuague dos veces con dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonda de hibridación
	<ol>
<li>Añadir ~ 4 gotas de la solución de sonda listo para su uso adecuado para cubrir toda la sección. Si usando secciones más grandes, añadir ~ 5-6 gotas.</li>
		<li>Hibridar las sondas por 2 h a 40 ° C en el horno de hibridación. Decantar la solución de las correderas y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificación de la señal
	<ol>
<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de AMP 0 por diapositiva a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado en este paso.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 1 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 2 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 3 AMP por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 4 amperios por porta a 40 ° C en el horno de hibridación durante 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 5 AMP por porta a temperatura ambiente durante 30 minutos decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
		<li>Incubar las secciones con ~ 4 gotas de 6 AMP por porta a temperatura ambiente por 15 minutos, decantar la solución y lave el portaobjetos en 200 mL de 1 x de tampón de lavado durante 2 min a temperatura ambiente con agitación ocasional. Repita el procedimiento de lavado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detección de señal
	<ol>
<li>Preparar el tinte rojo rápido de la solución. Para una diapositiva con una barrera de2 de 0.75 x 0.75 pulgadas, añadir 2 μL de colorante rápido rojo B a 120 μL de rápido rojo-A en un tubo y mezcle bien. Nota: Dependiendo del tamaño de la barrera hidrofóbica y el número de diapositivas, volúmenes de la solución de trabajo Fast Red variará.</li>
		<li>Decantar el exceso de líquido de las diapositivas y añadir el colorante Fast Red solución a las diapositivas. Incube los portaobjetos durante 10 min a temperatura ambiente en la bandeja con una cubierta para evitar la exposición a la luz. Nota: Use el Fast Red solución dentro de 5 minutos de preparación y no lo exponga a luz solar directa o luz ultravioleta.</li>
		<li>Decantar la solución Fast Red y enjuague los portaobjetos dos veces con agua del grifo. Vuelva a colocar los portaobjetos en una parrilla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Contratinción
	<ol>
<li>Contratinción las secciones de tejido con solución de hematoxilina de Gill 50% por 2 min en RT. Wash los portaobjetos con agua y repetir este proceso varias veces hasta que las diapositivas son claras, mientras que las secciones permanecen púrpura. Sumerja los portaobjetos en agua de amoníaco 0,02% para azulado (dip 2 a 3 veces). Reemplace el agua de amoníaco con agua del grifo y lavar las diapositivas 3 a 5 veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deslice el montaje
	<ol>
<li>Seco el portaobjetos en un horno de aire circulante a 60 ° C durante 15 minutos o a temperatura ambiente hasta totalmente seco. Coloque 1-2 gotas de reactivo de montaje en cada cubreobjetos portaobjetos y coloque sobre cada sección. Evitar cualquier captura de burbujas de aire. Secar los portaobjetos durante al menos 5 minutos. Nota: El substrato de Fast Red es sensible al alcohol. Deshidratar el portaobjetos en el alcohol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Visualización
	<ol>
<li>Observe los portaobjetos en un microscopio de campo luminoso estándar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/">https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/</a> (2016)</li><li>An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+and+EGFRvIII+in+glioblastoma:+signaling+pathways+and+targeted+therapies.">Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies.</a> Oncogene. , (2018).</li><li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+MET+via+diverse+exon+14+splicing+alterations+occurs+in+multiple+tumor+types+and+confers+clinical+sensitivity+to+MET+inhibitors.">Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.</a> Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).</li><li>Awad, M. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Baker, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+RNA-based+in+situ+mutation+detection+delineates+colorectal+cancer+subclonal+evolution.">Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution.</a> Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).</li></ol>

Todos los autores son empleados por la célula de Advanced Diagnostics, Inc.

En este informe, el protocolo de ensayo novela de ISH y sus aplicaciones fueron discutidos en detalle. El ensayo permite la visualización directa de uniones exón, short blanco y altamente homólogas secuencias y mutaciones puntuales en el contexto del tejido. El ensayo se basa en la tecnología de RNAscope5 y por lo tanto es capaz de detectar la molécula sola. Sin embargo, debido a un sistema de amplificación avanzados, la señal puede ser detectada con sondas que contienen tan poco como un par de doble-Z o con una longitud de plantilla de destino de sólo 50 nucleótidos. Porque las puntas de prueba pueden ser tan cortos como un único doble-Z de longitud, esto permite la detección de uniones exón, poco objetivo y altamente homólogas secuencias y mutaciones de punto (tabla 1).
Para el desempeño exitoso de la prueba, hay varias recomendaciones técnicas. En primer lugar, se deben fijar los tejidos en fresco 10% formol tamponado neutro (NBF) a temperatura ambiente durante 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) o overfixation (> 32 h) afectará el rendimiento de la prueba y puede requerir optimización adicional. En segundo lugar, para asegurar un control óptimo de temperatura y humedad, que son necesarios para la amplificación de hibridación y la señal de sonda robusta, la diapositiva procesamiento horno sistema e hibridación se debe utilizar para pasos de protocolo 2.3 a 5 (proteasa tratamiento previo, punta de prueba hibridación, amplificación de la señal y detección de señales). Búferes residual de tercera, el exceso deben ser decantados correctamente antes de cada paso en el protocolo (pero no tanto para que las secciones de tejido se sequen). Si el portaobjetos se sequen, desarrollará importante señal no específica. En cuarto lugar, dependiendo del tipo de tejido, optimización tratamiento previo puede ser necesario. Usando la proteasa mal o realizar subóptima durante un tiempo puede resultar en bajo - o sobre - digestion y afectará negativamente a la señal. Por último, es importante para que funcione siempre controles positivos y negativos con las puntas de prueba. Sondas de control negativo aseguran de que no hay ninguna señal de fondo, sondas de control positivo garantizar que el ensayo se ha realizado correctamente y que la calidad del RNA de la muestra es óptima para interpretar los resultados de la sonda de prueba. Si no hay señal con la sonda de control positivo, entonces es probable que la calidad del RNA de la muestra subóptima y una señal no puede ser vista con la sonda de prueba.
Además el análisis manual, la capacidad para realizar el ensayo en teñidores automáticos también fue demostrada (figura 6). Este ensayo automatizado de ISH rinde un alto cociente signal-to-noise y es aplicable para las mismas aplicaciones como se muestra en la tabla 1; sin embargo, beneficios de un análisis automatizado incluyen la estandarización de las condiciones analíticas, minimización de la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y permiso para el cribado de alto rendimiento de las muestras de tejido de forma fiable.
Inmunohistoquímica (IHQ) y qRT-PCR permiten la detección de variantes de empalme (particularmente EGFRvIII), en las muestras clínicas FFPE, estas técnicas pueden carecer de la especificidad necesaria y no ofrece una visión en la resolución espacial del empalme expresión variante, respectivamente11,12. Una ventaja clave del análisis de este protocolo es su visualización altamente sensible y específico de uniones de empalme preservando el contexto morfológico del tejido. Aquí, capacidad de análisis objetivo precisamente uniones exón único para diversas variantes de empalme, incluyendo EGFRvIII y METΔ14, fue demostrada (figuras 3 y 6). Además, el ensayo se ha demostrado para detectar la variante de empalme AR V7 en el cáncer de próstata, múltiples isoformas de ErbB4 en el cerebro y la confirmación de octavos de final de la circular Cdr1as de ARN en el ratón cerebro3,13,14.
Detección de secuencia destino corto por este ensayo ISH permite visualización de secuencias de ARN tan cortas como 50 nucleótidos de longitud, según lo demostrado por la detección de secuencias CDR3 derivado de células Jurkat (figura 3). El ensayo también puede detectar secuencias de genes son altamente homólogas a otros miembros de la familia o especie, como se muestra por Revêchon et al., que utiliza el ensayo corto blanco para detectar progerina humana expresada en ratón subcutáneo tejido adiposo blanco15. Además, ARN nucleolar pequeño (snoRNA) edición de genes mediada por CRISPR y microRNA precursor pueden ser detectado en situ con el ensayo corto destino. Más recientemente, Fu et al. combinado este ensayo ISH con IHC para identificar células precisa en la retina expresando el pre-miRNA mir125b16.
Mutación de perfiles en los tumores es fundamental para estudiar la progresión de tumores y para el desarrollo de terapias dirigidas. Mientras que la mutación de perfiles pueden lograrse mediante secuenciación de alto rendimiento, esta tecnología no puede enfrentar completamente intratumoral heterogeneidad o enlace de alteraciones genéticas con morfología celular17,18. La detección de mutaciones puntuales mediante este ensayo ISH permite la distinción de secuencias de RNA Diana con una resolución de la solo-base, como validada por la detección de variaciones de un solo nucleótido L858R de EGFR y KRAS G12A en líneas celulares (figura 5). Por otra parte, Baker et al. usaron el ensayo de mutación de punto a múltiples mutaciones en los oncogenes PIK3CA, BRAF y KRAS en cáncer colorrectal18. Fueron capaces de identificar y mapa espacial raras subclones mutantes de células del tumor, en última instancia mostrando cómo contribuyen a la heterogeneidad intra-tumor.
En Resumen, se ha desarrollado un ensayo de ARN ISH especializado. Esta metodología permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ. Es sensible, específico, cuantificable y adaptable desempeño por métodos manuales y en teñidores automáticos.

Tecnologías de alto rendimiento transcriptómicos como microarrays y la secuenciación de próxima generación RNA (RNAseq) han mejorado exponencialmente el descubrimiento de biomarcadores de RNA con valor clínico diagnóstico, pronóstico y predictivo de varias enfermedades incluyendo cáncer1,2. Para avanzar en el uso de estos biomarcadores en la medicina de precisión, hay una alta necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que puede medir biomarcadores de RNA en el contexto del tejido de las muestras clínicas. Mientras que ampliamente establecido ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensible, la homogeneización del tejido requerido y el aislamiento de RNA implican la pérdida de en vivo especificidad de tipo celular y información morfológica3. Metodologías de detección convencional en situ RNA carecen de la sensibilidad y especificidad necesaria para medir fiablemente biomarcadores RNA raras o baja expresión dentro del contexto de tejido4.
Un ensayo comercial en situ hibridación (ISH) (e.g., el ensayo de RNAscope) es una tecnología que ha abordado estos retos y también permite la visualización altamente sensible y específica de solo moléculas de ARN superiores a 300 nucleótidos en el contexto morfológico del tejido. Este tipo de análisis utiliza un diseño de la sonda de oligonucleótidos única de aproximadamente 6 – 20 pares de doble Z sonda combinada con una amplificación de señal avanzada basada en hibridación5.
Este estudio describe un análisis especializado de ARN ISH, BaseScope, complementaria a la tecnología comercial previamente diseñada que permite detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en la resolución de un solo nucleótido. Este ensayo aborda las intrincadas complejidades del transcriptoma y es aplicable para la detección exacta de uniones exón, secuencias diana corta y mutaciones puntuales en el contexto del tejido (tabla 1) utilizando una sonda doble Z. Este informe demuestra el protocolo completo y su uso en la detección de variantes de empalme, secuencias CDR3 de clones de células T del receptor, y mutaciones del solo-nucleótido en FFPE líneas y tejidos de tumor de la célula.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

Porque medicina de precisión depende de la precisa detección de biomarcadores, existe una creciente necesidad de tecnologías estandarizadas y robustas que miden RNA biomarcadores en situ en las muestras clínicas. Mientras los ensayos de rutina y atar como RNAseq y RT-PCR cuantitativa permiten mediciones de expresión génica altamente sensibles, también requieren extracción de RNA y así evitar análisis valiosa expresión dentro del contexto morfológico del tejido. El ensayo de hibridación (ISH) en situ descrito aquí puede detectar secuencias de RNA Diana tan cortos como 50 nucleótidos en resolución del solo-nucleótido y en el nivel unicelular. Este ensayo es complementario para el análisis comercial previamente desarrollado y permite la detección sensible y específica en situ de variantes de empalme, metas cortas y mutaciones puntuales dentro del tejido. En este protocolo, las puntas de prueba fueron diseñadas para uniones exón único para dos variantes de empalme clínicamente importantes, EGFRvIII y METΔ14 de destino. La detección de secuencias diana pocos fue demostrada por la detección específica de secuencias CDR3 del T-cell los receptores α y β en la línea de células Jurkat T. También se muestra es la utilidad de este análisis de la ISH para la distinción de secuencias de ARN Diana en la resolución del solo-nucleótido (mutaciones puntuales) a través de la visualización de L858R de EGFR y KRAS G12A variaciones del solo-nucleótido en líneas celulares usando tinción automatizada plataformas. En Resumen, el protocolo muestra un ensayo de ARN ISH especializado que permite la detección de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en situ para funcionamiento manual y en teñidores automáticos.

En situ hibridación análisis flujo de trabajo: El flujo de trabajo se representa en la figura 1 y consiste en cuatro partes: permeabilización de células o tejidos con destino recuperación y soluciones de la proteasa, hibridación de las sondas en el destino del RNA, señal de amplificación y la visualización de la señal. La señal también puede ser cuantificada usando sistemas de software de imagen digital o de manera semicuantitativa basado en el número de puntos por la célula. El procedimiento manual que se describe en la figura 2 también ha sido totalmente automática en sistemas comerciales de tinción automática.
Representante de tinción para la detección de empalme del exón (EGFRvIII empalme variante): EGFRvIII es una variante del receptor del factor de crecimiento epidérmico que surge de una canceladura genomic en el marco de los exones 2 a 7, constitutivamente activa señalización oncogénica7 . El análisis fue utilizado para identificar estado de EGFRvIII en muestras tumorales FFPE glioblastoma (GBM). Sondas de doble Z solo fueron diseñadas para abarcar las uniones exón con el fin de detectar cualquier peso, mutante, o ambas transcripciones (Figura 3A). Las sondas de EGFR WT abarcan a las uniones de exones 1 y 2 (E1/E2) o de los exones 7 y 8 (E7/E8), mientras que las sondas específicas de la EGFRvIII abarcan al empalme de los exones 1 y 8 (E1/E8). Una punta de prueba común que se extiende por la Unión de los exones 8 y 9 (E8/E9) también fue utilizado para detectar EGFR total (WT y EGFRvIII transcripciones). Todas las sondas entonces fueron utilizadas para determinar el estado EGFR en muestras de FFPE GBM. Los dos ejemplos representativos que se muestra en la figura 3B se tomaron de un estudio más amplio. Estado EGFR fue confirmada por un método independiente, RT-PCR. Ambas sondas WT detectan señal en ambas muestras, lo que indica que las dos muestras expresan EGFR WT (figura 3B). Sin embargo, la sonda mutante mostró sólo detección de señal en la EGFRvIII + muestra, confirmando que esta muestra es de hecho positiva para la variante de EGFRvIII (figura 3B, paneles de la izquierda). Por el contrario, la sonda mutante no detecta señal de la EGFRvIII-muestra (figura 3B, paneles de la derecha). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el análisis de empalme del exón puede identificar EGFRvIII estado en muestras tumorales de GBM FFPE.
Representante de coloración para metas corto: Los CDR3, o región determinante complementario 3, es un dominio altamente variable en receptores de célula T. Por lo general, la secuencia de CDR3 son bastante corto; por ejemplo, las secuencias CDR3 α y β de la línea de células Jurkat T son 51 y 48 nucleótidos de longitud, respectivamente (Figura 4A). Para identificar las secuencias específicas de CDR expresadas en células Jurkat, sondas antisentidas para CDR3 se generaron α y β que se expresan en la línea de células Jurkat T, además de sentido sondas para CDR3 α y β para servir como control negativo sondas. Todas las sondas entonces fueron probadas en células Jurkat FFPE-preparado con el ensayo. Se observó coloración robusta con sondas anti-sentido para ambos CDR3 α y β en las células de Jurkat, mientras que las sondas sentido no detecta poca a ninguna señal (Figura 4B). Estos resultados demuestran la capacidad de discernir entre secuencias de CDR altamente variable, pero corto para los clones de células T del receptor del ensayo corto blanco.
Representante para punto de mutación L858R de EGFR: Puntas de prueba de mutación de punto fueron desarrollados para detectar variaciones de un solo nucleótido y pequeñas inserciones o deleciones (INDELs) dentro del tumor. Figura 5A se muestra la capacidad para en situ detección de la mutación de punto L858R de EGFR (2573T > G). Dos puntas de prueba fueron diseñados: uno para detectar la L858R transformado secuencia EGFR y otro para detectar la secuencia de EGFR L858 WT. Ambas sondas fueron probados en dos líneas celulares FFPE-preparado: H2229, que sólo expresa EGFR L858 WT; y H1975, que es heterozigótico para la mutación L858R de EGFR. La sonda mutante L858R detectado señal sólo en la línea celular de H1975 pero no en la línea celular de H2229. Sin embargo, la sonda WT había detectado señal en ambas líneas celulares. Asimismo, figura 5B visualiza en situ detección de la mutación de punto G12A KRAS (35 G > C). Dos puntas de prueba fueron diseñados para detectar las secuencias KRAS G12A MT y KRAS WT de G12 y entonces probados en la línea celular de HuT78 (que sólo expresa KRAS WT de G12) y la línea de celular SW116 (que es heterozigótica para la mutación KRAS G12A). Mientras que la punta de prueba de KRAS WT de G12 detecta señal en ambas líneas celulares, la punta de prueba de KRAS G12A solo detectó señal en la línea de celular SW116. Tomados en conjunto, estos datos demuestran la capacidad técnica de la prueba de mutación de punto en la detección de polimorfismos de nucleótido único en el contexto de la célula y tejido.
Representante para el análisis automatizado en situ : Ensayos automatizados permiten un mayor número de muestras a ejecutar más confiablemente, minimizando la variabilidad inter-usuario y tiempo de práctica y generar resultados consistentemente reproducibles. Por lo tanto, se desarrolló una versión automatizada de la prueba. Para demostrar de tinción automatizado con este análisis, la detección de la variante de empalme METΔ14 fue examinada. Esta variante es el resultado del exón 14 en el gen MET ser omitido durante el pre-ARNm splicing, que conduce a la activación constitutiva y transformación oncogénica de la MET del receptor8,9. Para detectar específicamente la variante de METΔ14, se diseñaron dos sondas de empalme del exón: uno que abarca la Unión de los exones 13 y 15 (E13/E15) para detectar la transcripción de la variante de METΔ14 y otro que abarca la Unión de los exones 14 y 15 (E14/E15) para detectar la WT se reunió transcripción (figura 6A). Ambas sondas fueron probados entonces en 2 líneas celulares FFPE-preparado: H596, que expresa la variante METΔ14, y A549, que expresa el gen WT se reunió. Ambas sondas mostraron patrones de expresión mutuamente exclusiva, con la sonda E13/E15 sólo detección de señal en las células H596 y la sonda de E14/E15 sólo detección de señal en las células A549 (figuras 6B y 6C). Por último, la sonda para dapB no demostró ninguna señal, ninguna señal de fondo (figuras 6B y 6C). En general, estos datos muestra la detección específica de la MET variante METΔ14 en situ utilizando el ensayo automatizado de BaseScope.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> Figura 1 : El flujo de trabajo de análisis. El flujo de trabajo consta de 4 pasos principales: pretratamiento para permeabilizar las células o tejido, hibridación de la sonda a destino RNA, la amplificación de la señal y detección de la señal de visualización bajo el microscopio de campo luminoso o fluorescentes. Puntos que se pueden cuantificar utilizando una plataforma de análisis de imagen digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> Figura 2 : Ilustración del Protocolo de ensayo manual. El ensayo completo puede completarse en 9 h. pretratamiento los tiempos pueden variar dependiendo del tipo de tejido, por lo que se recomienda consultar el Apéndice A del manual de usuario para recomendaciones de tratamiento previo del tejido en cuanto a tiempo de incubación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> Figura 3 : Imágenes representativas de la detección de empalme exón. (A) se muestra aquí son la organización de exón para EGFR WT y EGFRvIII transcripciones y un esquema con doble Z exón cruce las puntas de prueba que unen el cruce para detectar el peso de EGFR o EGFRvIII. (B) el exón cruce análisis fue realizado en dos muestras de glioblastoma FFPE usando las puntas de prueba listados en (A), así como un dapB sonda control POLR2A y sonda de control negativo, positivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> Figura 4 : Detección de la secuencia de imágenes representativas del objetivo corto. (A) se muestra aquí son secuencias CDR3 en células Jurkat. La secuencia de negro es una secuencia común de flanquea y la secuencia en rojo es única a CDR3α o a CDR3β. Sondas de secuencia de doble Z corto destino fueron diseñadas contra estas secuencias. (B) el ensayo corto blanco fue realizado en células Jurkat preparadas como un precipitado de células FFPE usando sondas anti-sentido o sentido a las secuencias de (A), y dapB fue utilizado como control negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> Figura 5 : Imágenes representativas de la detección de la mutación de punto de. (A) el ensayo fue realizado en H2229 células (homocigóticas para EGFR L858) y H1975 (heterocigotos para la mutación L858R de EGFR) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de EGFR L858 WT o L858R de EGFR secuencia mutada. (B) el ensayo de mutación de punto fue realizada en HuT78 células (homocigóticas para G12A KRAS) y SW116 (heterozigótico para la mutación KRAS G12A) preparado como un precipitado de células FFPE usando puntas de prueba de una mutación de punto doble-Z a la secuencia de KRAS WT de G12 o Secuencia de G12A KRAS mutado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> Figura 6 : Imágenes representativas de tinción automatizado con el ensayo de empalme exón. (A) se muestra aquí es la organización de exón para transcripciones de WT se reunieron y METΔ14 y un esquema que representa el único exón Z doble cruce las puntas de prueba que unen la ensambladura para la detección de peso conocido o METΔ14. (B) y (C) el análisis de empalme del exón automatizado fue realizado en células A549 (expresando el peso conocido) preparadas como un precipitado de células FFPE usando las puntas de prueba listados en (A) y H596 las células (METΔ14) así como control negativo sonda dapB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Empalme del exón</td>
			<td>Secuencia corta</td>
			<td>Mutación de punto</td>
		</tr>
<tr>
<td>Empalme variante/isoforma</td>
			<td>Secuencias de entre 50 y 300 nt</td>
			<td>Mutación de punto</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA circular (circRNA)</td>
			<td>Secuencias altamente homólogas</td>
			<td>Indel corto</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fusión génica</td>
			<td>Secuencia de CDR3 para clones TCR</td>
			<td>Gen de edición</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nocaut (KO) en el gen</td>
			<td>Pre-miRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ARN nucleolar pequeño (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gen de edición</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: aplicaciones de la en situ análisis. Existen 3 categorías principales para las aplicaciones de este ensayo: ensambladura de exón, secuencia de destino corto y mutación de punto. En cada columna son algunos ejemplos de aplicación específica para cada categoría.

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Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

10.5K vistas.  Advanced Cell Diagnostics, Inc. Aquí, describimos un análisis en situ el hibridación que permite la detección sensible y específica de secuencias tan cortas como 50 nucleótidos con resolución del solo-nucleótido en el nivel unicelular. El ensayo, que se puede realizar manual o automáticamente, puede habilitar la visualización de variantes de empalme, secuencias cortas y mutaciones en el contexto del tejido.

Video: Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte doble entero hibridación in situ de embriones de pollo temprano

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radioactivo In situ La hibridación para la detección de diversos patrones de expresión génica en el tejido

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Replicación del cromosoma Timing Combinado con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...