In dieser Studie verwendeten menschlichen tumorproben wurden deidentifiziert und erwarb aus kommerziellen Quellen entsprechend den lokalen ethischen Richtlinien für Forschung am Menschen.
1. Probe, Ausrüstung und Reagenz Vorbereitung
<ol><li>
Proteinkinase Probenvorbereitung
	<ol>
<li>Gewebe<ol>
<li>Unmittelbar nach der Dissektion, das Gewebe (in Blöcken von 3 – 4 mm Dicke geschnitten) in 10 % Neutral gepufferte Formalin (NBF) für 16-32 h bei Raumtemperatur (RT) befestigen. Hinweis: Fixierzeit variiert je nach Gewebetyp und Größe.</li>
			<li>Waschen Sie die Probe mit 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und entwässern mit Hilfe einer standard Ethanol (EtOH) Reihe (70 % EtOH für 30 – 60 min, 80 % EtOH für 30 – 60 min, 90 % EtOH für 30 – 60 min, 95 % EtOH für 30 – 60 min, 3 x 100 % EtOH 30 – 60 min) gefolgt von Xylol.</li>
			<li>Betten Sie die Probe in Paraffin mit Standardverfahren6 ein und trimmen Sie der Paraffin-Blöcke je nach Bedarf entfernen überschüssiges Paraffin. Hinweis: Blockgröße ist abhängig von des Gewebe-Stichprobenumfangs, aber eine typische Größe ist 0,75 x 0,75 Zoll2 oder kleiner.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zell-Linien<ol>
<li>Sammeln und pellet-Zellen nach den empfohlenen Methoden für die spezifische Zell-Linie.</li>
			<li>Zellen in 10 % Formaldehyd bei RT für 24 h auf ein Rotator zu beheben.</li>
			<li>Bereiten Sie Zellen als ein Pellet in vorgewärmte Verarbeitung Gel (zB., Histogel). Ermöglichen Sie das Pellet, indem das Gel-Zell-Pellet auf ein Stück Parafilm auf Eis zu festigen, und lassen Sie es für 2 – 3 min. Submerge Gel-Zell-Pellet mit 1 X PBS-Puffer.</li>
			<li>Entwässern Sie und Betten Sie der Zelle Pellets wie in Schritt 1.1.1 beschrieben ein.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abschnitt Vorbereitung<ol>
<li>Die eingebetteten Gewebe/Zellen in 5 ± 1 μm Abschnitte mit einem Mikrotom geschnitten, montieren Sie die Abschnitte an elektrostatisch anhaftenden Objektträger und an der Luft trocknen sie über Nacht bei RT Hinweis: Die Folien können bei RT unter Austrocknung bis zu 3 Monate lang gespeichert werden.</li>
			<li>Legen Sie die Folien in einem Dia-Rack und Backen Sie montiert Gewebe Folien in einem zirkulierenden Luft Ofen bei 60 ° C für 1 h vor der Durchführung des Tests. Hinweis: Verwenden Sie die Folien sofort oder speichern sie bei RT mit Trockenmittel für bis zu 1 Woche. Längerer Lagerung kann RNA-Abbau führen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Ausrüstung
	<ol>
<li>Legen Sie die Hybridisierung Ofen bis 40 ° C. Gründlich nass befeuchtenden Papier entfernen Rückstände dH2O. Legen Sie das Papier in das Fach ein Feuchtigkeit Kontrolle und setzen Sie die Schale in den Ofen Hybridisierung, für mindestens 30 min vor Gebrauch prewarm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenz-Vorbereitung
	<ol>
<li>Füllen Sie zwei clearing Agent Gerichte mit 200 mL Xylol und zwei Färbung Tellern mit 200 mL 100 % EtOH, die für 4.wenn der Abschnitte verwendet werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 200 mL handelsübliche 1 X Ziel abrufen Reagenz durch Hinzufügen von 180 mL dH2O bis 20 mL 10 X Ziel abrufen Reagenz vor. Legen Sie zwei Objekthalter in einem Dampfer. Füllen Sie einen Diahalter mit 200 mL 1 x Ziel abrufen Reagenz und füllen Sie die anderen Diahalter mit 200 mL dH2O. Hitze beide Lösungen zum Kochen mit dem Steamer.</li>
		<li>Warmen 50 X Waschpuffer auf 40 ° C für 10 – 20 min. Vorbereitung 3 L 1 X Waschpuffer durch Verdünnung 60 mL vorgewärmt 50 X Waschpuffer mit 2,94 L dH2O.</li>
		<li>Bereiten Sie in einer Dampfhaube 50 % Gill Hämatoxylin gegenfärbung Lösung durch Zugabe von 100 mL Gills Hämatoxylin, 100 mL von dH2O. Bereiten Sie in der Dunstabzugshaube Bläuen Reagenz (0,02 % (w/V) Ammoniak Wasser) durch Zugabe von 1,43 mL 28 – 30 % Ammonium Hydroxid, 250 mL von dH2O.</li>
		<li>Prewarm Ziel-Sonden bei 40 ° C für 10 min vor der Sonde Hybridisierung und bringen die verstärkenden Reagenzien (AMP 0 – 6), RT</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) RNA In Situ Hybridisierung Assay
<ol><li>
4.wenn und Austrocknung
	<ol>
<li>Nach dem Backen wie im Schritt 1.1.3.2 beschrieben (optional Haltepunkt 1), deparaffinize die Abschnitte in Xylol für 5 min. unter Rühren. Deparaffinize wieder in frischem Xylol für 5 min. dehydrieren in 100 % EtOH für 2 min mit Agitation und Wiederholung wieder in frische 100 % EtOH 2 min. lang.</li>
		<li>Luft trocknen die Folien für 5 min bei 60 ° C in einem zirkulierenden Luft Ofen oder bei RT Trocknen bis sie vollständig sind (optional Haltepunkt 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Probe Vorbehandlungen
	<ol>
<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen von Ready-to-Use Wasserstoffperoxid für 10 min bei RT die endogenen Peroxidase-Aktivität zu stillen. Dekantieren Sie die Lösung von den Folien zu und spülen Sie sie zweimal mit dH2O.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit 200 mL das Ziel abrufen Reagenz für 15-30 min bei 100 ° C in einem Dampfer. Hinweis: Inkubationszeit variieren je nach Gewebetyp. In diesem Protokoll wurde Ziel abrufen für 15 min für tumorproben und Zelle Pellets durchgeführt.</li>
		<li>Die Lösung von den Folien zu Dekantieren, spülen Sie zweimal mit dH2O, Tauchen Sie ein in 100 % EtOH für 3 min und trocknen die Folien bei 60 ° C in einem zirkulierenden Luft Ofen oder bei RT bis Sie vollständig trocknen.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um den Bereich mit einem hydrophoben Stift, ca. 0,75 x 0,75 Zoll2. Hinweis: Es wird nicht empfohlen, ein kleineres Hindernis zu ziehen. Für größere Teile müssen eine größere Barriere gezogen werden.</li>
		<li>Lassen Sie die Barriere für 1 min vollständig trocknen, oder lassen Sie über Nacht bei RT (optional Haltepunkt 3).</li>
		<li>Legen Sie die Folien in einen Diahalter und legen Sie den Diahalter in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach. ~ 4 Tropfen Protease III zu jeder Folie und inkubieren sie 15-30 min bei 40 ° C im Backofen Hybridisierung Proteinverdauung. Hinweis: Inkubationszeit variieren je nach Gewebe. In diesem Protokoll wurde Protease Verdauung für 30 min für tumorproben und 15 min für Zelle Pellets durchgeführt.</li>
		<li>Dekantieren Sie die Lösung von den Folien zu und spülen Sie sie zweimal mit dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonde Hybridisierung
	<ol>
<li>~ 4 Tropfen der entsprechenden Ready-to-Use-Sonde Lösung um den gesamten Bereich abzudecken. Wenn größere Teile zu verwenden, fügen Sie ca. 5 – 6 Tropfen.</li>
		<li>Hybridisieren Sie die Sonden für 2 h bei 40 ° C im Ofen Hybridisierung. Dekantieren Sie die Lösung von den Folien zu und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie in diesem Schritt des Waschvorgangs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Signalverstärkung
	<ol>
<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 0 pro Folie bei 40 ° C im Ofen für 30 min. Dekantieren die Lösung Hybridisierung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 X Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie in diesem Schritt des Waschvorgangs.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 1 pro Folie bei 40 ° C im Ofen für 15 min. Dekantieren die Lösung Hybridisierung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 2 pro Folie bei 40 ° C im Ofen für 30 min. Dekantieren die Lösung Hybridisierung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 3 pro Folie bei 40 ° C im Ofen für 30 min. Dekantieren die Lösung Hybridisierung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 4 pro Folie bei 40 ° C im Ofen für 15 min. Dekantieren die Lösung Hybridisierung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Brüten Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 5 pro Folie bei RT für 30 min. Dekantieren die Lösung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Brüten Sie die Abschnitte mit ~ 4 Tropfen des AMP 6 pro Folie bei RT für 15 min. Dekantieren die Lösung und waschen Sie die Folien in 200 mL 1 x Waschpuffer für 2 min bei RT mit gelegentlichen Agitation. Wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Signalerkennung
	<ol>
<li>Vorbereiten des schnell rote Farbstoffs Lösung arbeiten. Eine Folie mit einer 0,75 x 0,75 Zoll2 Barriere hinzufügen 2 μL des Farbstoffes schnell rot-B 120 μL schnell rot-A in eine Röhre und gut mischen. Hinweis: Abhängig von der Größe der hydrophobe Barriere und die Anzahl der Folien variiert Datenmengen schnell rot funktionierende Lösung.</li>
		<li>Die überschüssige Flüssigkeit aus den Folien zu dekantieren und Hinzufügen des schnell rote Farbstoffs Lösung zu den Folien arbeiten. Inkubieren Sie die Folien für 10 min bei RT in das Fach mit einer Abdeckung, um Lichteinfall zu vermeiden. Hinweis: Verwenden Sie die Fast Red arbeiten Lösung innerhalb von 5 min Vorbereitung, und setzen Sie es nicht direktem Sonnenlicht oder UV-Licht.</li>
		<li>Dekantieren Sie Fast Red-Lösung und spülen Sie die Folien zweimal mit Leitungswasser. Legen Sie die Folien wieder in einem Dia-Rack.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gegenfärbung
	<ol>
<li>Counterstain Gewebeschnitte mit 50 % Gill Hämatoxylin Lösung für 2 min bei RT. Wash Folien mit Leitungswasser und dies mehrmals wiederholen, bis die Folien liegen auf der Hand, während die Abschnitte lila bleiben. Tauchen Sie die Folien in 0,02 % Ammoniak Wasser zum Bläuen (dip 2 – 3 mal). Ersetzen Sie das Ammoniak-Wasser mit Leitungswasser und waschen Sie der Objektträger 3 – 5 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schieben Sie Montage
	<ol>
<li>Trocken trocknen Sie die Folien in einem zirkulierenden Luft Ofen bei 60 ° C für 15 min oder bei RT bis Sie vollständig. Platzieren Sie 1 – 2 Tropfen Reagenz Montage auf jeder Folie und Ort Deckgläsern, über jeden Abschnitt. Überfüllung von Luftblasen zu vermeiden. Die Folien für mindestens 5 min der Luft trocknen lassen. Hinweis: Das Substrat schnell rot ist Alkohol-und Kleinschreibung. Folien in Alkohol nicht austrocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Visualisierung
	<ol>
<li>Die Folien unter dem standard Hellfeld-Mikroskop zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Alle Autoren werden von Advanced Cell Diagnostics, Inc. beschäftigt.

In diesem Bericht wurden die neuartigen ISH Assay-Protokoll und seine Anwendungen im Detail besprochen. Der Test ermöglicht die direkte Visualisierung der Exon-Kreuzungen, kurz-Ziel und hochgradig homologe Sequenzen und Punktmutationen im Zusammenhang mit Gewebe. Der Test basiert auf RNAscope Technologie5 und ist daher in der Lage der Einzelmolekül-Erkennung. Jedoch kann durch eine erweiterte Verstärkersystem, das Signal mit Sonden mit so wenig wie ein Doppel-Z-Paar oder mit einer Ziel-Vorlage-Länge von nur 50 Nukleotide erkannt werden. Da die Sonden so kurz wie ein einziges Doppel-Z Länge sein können, können zum Nachweis von Exon Kreuzungen, kurz-Ziel und hochgradig homologe Sequenzen und Punktmutationen (Tabelle 1).
Für eine erfolgreiche Leistung des Assays gibt es mehrere technische Empfehlungen. Zuerst Gewebe in frischen 10 % Neutral gepufferte Formalin (NBF) bei Raumtemperatur für 16-32 h10festzusetzen. Underfixation (< 16 h) oder Overfixation (> 32 h) wird die Leistung des Assays beeinträchtigen und möglicherweise zusätzliche Optimierung. Zweitens sollte dafür optimale Steuerung von Temperatur und Luftfeuchtigkeit, die für robuste Sonde Hybridisierung und Signal-Verstärkung erforderlich sind, die Folie Verarbeitung System und Hybridisierung Ofen für Protokoll Schritte 2,3 bis 5 (Protease Vorbehandlung, Sonde verwendet werden Hybridisierung, Signalverstärkung und Signalerkennung). Drittens: überschüssige Rest Puffer sollte vor jedem Schritt im gesamten Protokoll richtig dekantiert (aber nicht so sehr, dass die Gewebeschnitte Austrocknen). Wenn die Folien austrocknen, werden erhebliches unspezifisches Signal entwickeln. Viertens kann je nach Gewebetyp, Vorbehandlung Optimierung erforderlich. Verwendung der falschen Protease oder eine suboptimale lang durchführen kann in unter - oder over - digestion und wirken sich negativ auf das Signal. Zu guter Letzt ist es wichtig, immer positive und negative Kontrollen mit den Prüfspitzen laufen. Negativkontrolle Sonden sicherzustellen, dass keine Hintergrundsignal vorhanden ist, und Positivkontrolle Sonden stellen Sie sicher, dass der Test korrekt durchgeführt wurde und die RNA-Qualität in der Probe optimal ist für die Interpretation der Testergebnisse Sonde. Wenn es kein Signal mit der Positivkontrolle Sonde, dann die RNA-Qualität in der Stichprobe dürfte suboptimal und ein Signal nicht mit der Prüfspitze gesehen werden kann.
Neben der manuellen Test wurde die Leistungsfähigkeit des Tests auf automatisierte freigesprochen auch gezeigt (Abbildung 6). Dieser automatisierte ISH-Assay ergibt sich ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und eignet sich für die gleichen Anwendungen wie in Tabelle 1dargestellt; jedoch Vorteile einer automatisierten Tests gehören Standardisierung der Assay-Bedingungen, Minimierung von Inter Benutzer Variabilität und Hands-on-Zeit und Zulage für Hochdurchsatz-Screening von Gewebeproben auf zuverlässige Weise.
Während Immunhistochemie (IHC) und qRT-PCR zur Detektion von Splice-Varianten (besonders EGFRvIII), in klinischen Proben FFPE erlauben, diese Techniken können nicht über die erforderliche Spezifität und bieten keinen Einblick in die räumliche Auflösung des spleißes Variant Ausdruck, bzw.11,12. Ein entscheidender Vorteil des Assays in diesem Protokoll ist seine sehr empfindlich und spezifisch Visualisierung der Spleiß Kreuzungen unter Beibehaltung der morphologischen Gewebe-Kontext. Hier war der Assay Fähigkeit, einzigartige Exon Kreuzungen für mehrere Splice-Varianten, einschließlich EGFRvIII und METΔ14, präzise Ziel gezeigt (Abbildungen 3 und 6). Darüber hinaus hat der Test gezeigt, spleißvariante AR-V7 in Prostata-Krebs, mehrere Isoformen von ErbB4 im Gehirn und Bestätigung der Ko von kreisförmigen RNA-Cdr1as in der Maus Gehirn3,13,14erkennen.
Kurze Sequenz Zielerfassung von ISH Assays kann zur Visualisierung der RNA-Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide in der Länge, wie gezeigt durch den Nachweis des CDR3 Sequenzen Jurkat Zellen (Abbildung 3) abgeleitet. Der Test kann auch erkennen, Gensequenzen, die höchst Homolog zu anderen Familienmitgliedern oder Arten, dargestellt durch Revêchon Et Al., wer den kurzen Ziel-Assay verwendet, um menschliche Progerin ausgedrückt in Maus subkutane weißen Fettgewebe15erkennen. Darüber hinaus können kleine Nukleolus RNA (SnoRNA), CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Vorläufer-RNA erkannten in Situ mit der kurzen Ziel-Test sein. In jüngerer Zeit, kombiniert Fu Et Al. ISH Assays mit IHC, präzise Zellen in der Netzhaut, die mit dem Ausdruck der Pre-MiRNA mir125b16zu identifizieren.
Mutation, die Profilerstellung in Tumoren ist von entscheidender Bedeutung für das Studium der Progression von Tumoren und für gezielte Therapien zu entwickeln. Während Mutation Profilierung durch Hochdurchsatz-Sequenzierung erreicht werden kann, kann nicht diese Technologie intratumorale Heterogenität oder Link genetische Veränderungen mit zellulären Morphologie17,18vollständig behandelt. Der Nachweis von Punktmutationen mit dieser ISH-Assay kann zur Unterscheidung von RNA-Ziel-Sequenzen mit einer Single-Base-Auflösung als validiert durch den Nachweis des EGFR L858R und KRAS G12A Einzel-Nukleotid-Variationen in Zelllinien (Abbildung 5). Darüber hinaus verwendet Baker Et Al. die Punktmutation Assay mehrere Mutationen im BRAF, KRAS und PIK3CA Onkogene in colorectal Krebs18. Identifizieren und räumlich Karte selten mutierten Subclones von Tumorzellen, letztlich zeigen, wie sie zur Intra-Tumor Heterogenität beitragen konnten.
Zusammenfassend lässt sich sagen wurde eine spezielle RNA-ISH-Assay entwickelt. Diese Methodik ermöglicht die Erkennung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen in Situ. Es ist sensibel, konkrete, quantifizierbare und anpassungsfähig Leistung durch manuellen Methoden und auf automatisierten freigesprochen.

Transkriptomischen von Hochdurchsatz-Technologien wie Microarrays und Next-Gen-RNA-Sequenzierung (RNAseq) haben die Entdeckung der RNA-Biomarker mit diagnostischen, prognostischen und prädiktiven klinischen Wert für verschiedene Krankheiten einschließlich exponentiell verbessert. Krebs1,2. Um den Einsatz dieser Biomarker in der präzisionsmedizin zu fördern, gibt es ein hohen Bedarf an standardisierten und robuste Technologien, die RNA Biomarker die Gewebe im Rahmen von klinischen Proben messen kann. Während allgemein etabliert, Grind und Bind-Assays wie RNAseq und quantitative RT-PCR ermöglichen hochsensiblen Gen Ausdruck Messungen, die erforderlichen Gewebe Homogenisierung und RNA Isolierung bedeuten den Verlust der in Vivo Zelltyp Spezifität und morphologische Informationen3. Konventionelle in Situ RNA Erkennung Methoden fehlen die Sensitivität und Spezifität erforderlich, um seltene oder niedrigen exprimierenden RNA Biomarker innerhalb der Gewebe Kontext4zuverlässig messen.
Eine kommerzielle in Situ -Hybridisierung (ISH)-Assay (zB., die RNAscope-Assay) ist eine Technologie, die diese in Angriff genommen hat Herausforderungen und ermöglicht auch die hoch empfindliche und spezifische Visualisierung der einzelnen RNA-Moleküle, die größer als 300 Nukleotide im Gewebe morphologischen Kontext. Diese Art von Test verwendet eine einzigartige Oligonukleotid Sonde Design von ca. 6 – 20 Doppel-Z-Sonde Paaren kombiniert mit einer erweiterten Hybridisierung-basierte Signal Verstärkung5.
Diese Studie beschreibt einen speziellen RNA-ISH Assay, BaseScope, ergänzend zu der zuvor entworfenen kommerzielle Technologie, die RNA-Zielsequenzen so kurz wie 50 Nukleotide bei Einzel-Nukleotid-Auflösung erkennen kann. Dieser Test befasst sich mit der komplizierten Komplexität des transkriptoms und gilt für die präzise Erkennung von Exon Kreuzungen, kurze Zielsequenzen und Punktmutationen im Gewebe Kontext (Tabelle 1) mit so wenig wie ein Doppel-Z-Sonde. Dieser Bericht zeigt das komplette Test-Protokoll und seine Verwendung bei der Erkennung von Splice-Varianten, CDR3-Sequenzen für T-Zell-Rezeptor-Klone, und Einzel-Nukleotid-Mutationen im FFPE Zell-Linien und Tumorgewebe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

Da präzisionsmedizin stark abhängig von der genauen Nachweis von Biomarkern ist, gibt es ein zunehmender Bedarf an standardisierten und robuste Technologien, die RNA Biomarker in Situ in klinischen Proben zu messen. Während die Grind-Bind-Assays wie RNAseq und quantitative RT-PCR ermöglichen hochsensiblen Gen Ausdruck Messungen, sie erfordern auch RNA-Extraktion und verhindern somit wertvolle Expressionsanalyse morphologische Gewebe im Rahmen. Die in Situ Hybridisierung (ISH)-Assay hier beschriebenen erkennt RNA Zielsequenzen 50 Nukleotide auf Einzel-Nukleotid-Auflösung und die einzelligen Ebene möglichst kurz. Dieser Test ist eine Ergänzung zu den bisher entwickelten kommerziellen Assay und ermöglicht die Sensitivität und Spezifität in Situ Detektion der Splice-Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen im Gewebe. In diesem Protokoll wurden Sonden entwickelt, um einzigartige Exon Kreuzungen für zwei klinisch relevanten Splice-Varianten, EGFRvIII und METΔ14 Ziel. Die Erkennung von kurzen Zielsequenzen zeigte sich durch den spezifischen Nachweis des CDR3 Sequenzen von T-Zell-Rezeptoren-α und β in der Jurkat T-Zell-Linie. Auch ist das Dienstprogramm des ISH Assays für die Unterscheidung von RNA-Zielsequenzen bei Einzel-Nukleotid-Auflösung (Punktmutationen) durch die Visualisierung der EGFR L858R und KRAS G12A Einzel-Nukleotid-Variationen in Zelllinien mit automatisierten Färbung Plattformen. Zusammenfassend zeigt das Protokoll einen spezialisierten RNA ISH-Assay, der es die Erkennung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen in Situ für manuelle und automatische freigesprochen ermöglicht.

Die in Situ Hybridisierung Assay Workflow: Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt und besteht aus vier Teilen: Permeabilisierung der Zellen oder Gewebe mit Ziel abrufen und Protease Lösungen, Hybridisierung der Sonden, die Ziel-RNA, signal-Verstärkung und Visualisierung des Signals. Das Signal kann auch mit Softwaresystemen für digitale Bildverarbeitung quantifiziert werden oder in einer semi-quantitative Weise anhand der Anzahl der Punkte pro Zelle. Manuelle Verfahren Sie wie in Abbildung 2 wurde auch in kommerziellen Auto Färbung Systemen vollständig automatisiert.
Repräsentative Färbung für Exon-Junction-Erkennung (EGFRvIII spleißvariante): EGFRvIII ist eine Variante des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors, das durch eine in-Frame genomische Löschung der Exons 2 bis 7 entsteht, führt zu konstitutiv aktiven Onkogenen Signalisierung7 . Der Test wurde verwendet, um EGFRvIII Status im tumorproben FFPE Glioblastom (GBM) zu identifizieren. Einzel-Doppel-Z-Probes wurden entwickelt, um der Exon-Kreuzungen erstrecken, um entweder WT zu erkennen Mutant oder beide Protokolle (Abb. 3A). WT EGFR-Sonden umfassen die Kreuzungen von Exons 1 und 2 (E1/E2) oder Exons 7 und 8 (E7/E8), während der EGFRvIII-spezifischen Sonden die Kreuzung von Exons 1 und 8 (E1/E8) erstrecken. Eine gemeinsame Sonde, die Kreuzung der Exons 8 und 9 (E8/E9) erstreckt wurde auch verwendet, um insgesamt EGFR (WT und EGFRvIII Transkripte) zu erkennen. Die Sonden wurden dann zur EGFR-Status in FFPE GBM Proben zu bestimmen. Die zwei Repräsentative Beispiele in Abb. 3 b stammen aus einer größeren Studie. EGFR-Status wurde durch eine unabhängige Methode, RT-PCR bestätigt. Beide Sonden WT erkannt Signal in beiden Proben, darauf hinweist, dass die beiden Proben WT EGFR (Abb. 3 b) zum Ausdruck bringen. Die mutierte Sonde ergab jedoch nur Signalerkennung im EGFRvIII + Beispiel bestätigt, dass dieses Beispiel zwar positiv für die EGFRvIII-Variante (Abb. 3 b, linken Panels). Im Gegensatz dazu hat die mutierte Sonde Signal in der EGFRvIII-Probe (Abb. 3 b, richtigen Platten) nicht erkannt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Exon-Junction-Assay EGFRvIII Status im GBM FFPE tumorproben identifizieren kann.
Vertreter für kurze Ziele Färbung: Die CDR3 oder ergänzende bestimmenden Region 3, ist eine sehr Variable Domäne in T-Zell-Rezeptoren. Die CDR3-Sequenz sind in der Regel recht kurz; Beispielsweise sind die CDR3 α und β-Sequenzen aus der Jurkat T-Zell-Linie 51 und 48 Nukleotide in der Länge, bzw. (Abb. 4A). Spezifischen CDR-Sequenzen in Jurkat Zellen, antisense Sonden für CDR3 ausgedrückt zu identifizieren α und β, die in der Jurkat T-Zell-Linie ausgedrückt sind entstanden, neben Sinn Sonden für CDR3 α und β, dienen als negative Kontrolle Sonden. Die Sonden wurden dann in FFPE vorbereitet Jurkat-Zellen mit dem Assay getestet. Robuste Färbung beobachtet wurde mit Anti-Sense-Sonden für beide CDR3 α und β in den Jurkat-Zellen, während Sinn-Sonden entdeckt wenig bis gar kein Signal (Abbildung 4 b). Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des kurzen Ziel-Assays, zwischen höchst Variable aber kurze CDR-Sequenzen für T-Zell-Rezeptor-Klone zu unterscheiden.
Vertreter für Punktmutation L858R EGFR Färbung: Punktmutation Sonden wurden entwickelt, um Einzel-Nukleotid-Variationen und kleine Einfügungen oder Löschungen (INDELs) im Zusammenhang mit Tumor zu erkennen. Abbildung 5A zeigt die Fähigkeit zur in Situ Detektion von Punktmutation L858R EGFR (2573T > G). Zwei Sonden wurden entwickelt: die Feststellung, die L858R mutierten EGFR-Sequenz, und eine andere, die EGFR L858 WT-Sequenz zu erkennen. Beide Sonden wurden in zwei FFPE vorbereitet Zelllinien getestet: H2229, das nur EGFR L858 WT ausdrückt; und H1975, die heterozygot für die Mutation L858R EGFR ist. Die L858R mutierte Sonde erkannt Signal nur in der H1975-Zell-Linie, aber nicht in die H2229-Zell-Linie. Jedoch entdeckt die WT-Sonde Signal in beiden Zelllinien. In ähnlicher Weise in Situ Detektion von Punktmutation KRAS G12A visualisiert Abbildung 5 b (35 G > C). Zwei Sonden wurden entwickelt, um die KRAS G12A MT und KRAS G12 WT Sequenzen zu erkennen und dann auf die HuT78-Zell-Linie (die nur KRAS G12 WT drückt) und die SW116-Zell-Linie (die heterozygot für die Mutation des KRAS G12A) getestet. Während die KRAS G12 WT-Sonde in beiden Zelllinien Signal erkannt, erkannt KRAS G12A Sonde nur Signal in die SW116-Zell-Linie. Zusammengenommen zeigen diese Daten die technische Fähigkeiten des Assays Punktmutation bei der Aufdeckung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen im Zusammenhang mit Zellen und Gewebe.
Vertreter für die automatisierte in Situ -Assay Färbung: Automatisierte Tests ermöglichen eine größere Anzahl von Proben mehr zuverlässig ausgeführt werden Inter Benutzer Variabilität und Hands-on-Zeit zu minimieren und erzeugen konstant reproduzierbare Ergebnisse. Daher wurde eine automatisierte Version des Assays entwickelt. Um automatisierte Färbung mit dieser Assay zu demonstrieren, wurde Erkennung von spleißvariante METΔ14 untersucht. Diese Variante ist das Ergebnis von Exon 14 im MET-gen während der Pre-mRNA Spleißen, führt zu konstitutiven Aktivierung und Onkogenen Transformation der MET Rezeptor8,9übersprungen. Um speziell die METΔ14 Variante zu erkennen, wurden zwei Exon-Junction-Sonden entwickelt: eine, die über der Kreuzung von Exons 13 und 15 (E13/E15), die METΔ14 Variante Abschrift zu erkennen, und eine andere, die Kreuzung der Exons 14 und 15 (E14/E15) zur Erkennung der WT MET erstreckt Transkript (Abb. 6A). Beide Sonden wurden dann in 2 FFPE vorbereitet Zelllinien getestet: H596, die die METΔ14-Variante zum Ausdruck bringt, und A549, die das WT traf gen zum Ausdruck bringt. Beide Sonden zeigten sich gegenseitig ausschließende Expressionsmuster E13/E15-Sonde nur Erkennung Signal in den H596 Zellen und die E14/E15-Sonde nur Erkennung Signal in den A549 Zellen (Zahlen 6 b und 6 C). Zu guter Letzt zeigte die Sonde für DapB kein Signal, kein Hintergrundsignal (Zahlen 6 b und 6 C) angibt. Insgesamt zeigt diese Daten spezifische Erkennung des MET Variante METΔ14 in Situ unter Verwendung der automatisierten BaseScope Assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> Abbildung 1 : Der Assay-Workflow. Der Workflow besteht aus 4 großen Schritten: Vorbehandlung, Zellen oder Gewebe, Sonde Hybridisierung, Ziel-RNA, permeabilize signal-Verstärkung und signal-Erkennung durch Visualisierung unter Hellfeld oder fluoreszierende Mikroskop. Einzelne Punkte können mit Hilfe eines digitalen Bildes Analyseplattform quantifiziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> Abbildung 2 : Abbildung des Protokolls manuelle Assay. Der gesamte Test kann in 9 h. Vorbehandlung erfolgen, die Zeiten je nach Gewebetyp, variieren so ist es ratsam, Anhang A in der Bedienungsanleitung für Gewebe Vorbehandlung Empfehlungen bezüglich Inkubationszeit zu konsultieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> Abbildung 3 : Repräsentative Bilder der Exon-Junction-Erkennung. (A) siehe hier sind die Exon-Organisation für EGFR WT und EGFRvIII Transkripte und eine schematische Darstellung der Doppel-Z Exon Kreuzung Sonden, die die Kreuzung um EGFR WT oder EGFRvIII erkennen zu überspannen. (B) das Exon-Junction-Assay wurde auf zwei FFPE Glioblastom Proben mit den Sonden aufgeführt in (A), sowie eine positive Kontrolle Sonde, POLR2A und Negativkontrolle Sonde, DapB durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> Abbildung 4 : Repräsentative Bilder von kurzen Ziel-Sequenz Erkennung. (A) siehe hier sind CDR3-Sequenzen in Jurkat Zellen. Die Sequenz in schwarz ist eine begleitende gemeinsame Sequenz und die Sequenz in rot ist einzigartig, entweder CDR3α oder CDR3β. Doppel-Z kurze Einzelziel Sequenz Sonden wurden gegen diese Sequenzen entwickelt. (B) die kurzen Ziel-Assay wurde auf Jurkat Zellen als eine Proteinkinase Zelle Pellet mit Anti-Sinn oder Sonden für die Sequenzen in (A) vorbereitet, und DapB diente als Negativkontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> Abbildung 5 : Repräsentative Bilder Punktmutation Nachweisgrenze. (A) der Test erfolgte am H2229 Zellen (homozygot für EGFR L858) und H1975 (heterozygot für die Mutation L858R EGFR) als eine Proteinkinase Zelle Pellet mit einzelnen Doppel-Z-Punktmutation Sonden Ausrichtung der EGFR L858 WT Sequenz oder EGFR L858R vorbereitet mutierten Sequenz. (B) die Punktmutation-Assay wurde am HuT78 (homozygot für KRAS G12A) und SW116 Zellen (heterozygot für die Mutation des KRAS G12A) als eine Proteinkinase Zelle Pellet mit einzelnen Doppel-Z-Punktmutation Sonden Ausrichtung der KRAS G12 WT-Sequenz durchgeführt oder KRAS G12A mutierten Sequenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> Abbildung 6 : Repräsentative Bilder der automatisierten Färbung mit dem Exon-Junction-Assay. (A) siehe hier ist die Exon-Organisation für traf WT und METΔ14 Zeugnisse und eine schematische Darstellung der einzelnen Doppel-Z-Exon Kreuzung Sonden, die überspannen die Kreuzung um traf WT oder METΔ14 zu erkennen. (B) und (C) automatisierte Exon-Junction-Assay wurde am H596 (Ausdruck von METΔ14) und A549 Zellen (Ausdruck erfüllt WT) als eine Proteinkinase Zelle Pellet mit den Sonden in (A) aufgeführten vorbereitet sowie Negativkontrolle Sonde DapB durchgeführt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exon-Junction</td>
			<td>Kurze Sequenz</td>
			<td>Punktmutation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Splice-Variante/isoform</td>
			<td>Sequenzen zwischen 50 und 300 nt</td>
			<td>Punktmutation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kreisförmige RNA (CircRNA)</td>
			<td>Hochgradig homologe Sequenzen</td>
			<td>Kurze indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gen fusion</td>
			<td>CDR3-Sequenz für TCR Klone</td>
			<td>Gen, die Bearbeitung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gen Knockout (KO)</td>
			<td>Pre-miRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Kleinen Nukleolus RNA (SnoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gen, die Bearbeitung</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Anwendungen von der in situ Assay. Es gibt 3 Hauptkategorien für Anwendungen des Assays: Exon-Junction, kurze Zielsequenz und Punktmutation. In jeder Spalte aufgeführt sind einige spezifische Anwendungsbeispiele für jede Kategorie.

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Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

10.5K Aufrufe.  Advanced Cell Diagnostics, Inc. Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Serie: Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung in whole mount Embryonen und Histologie für Marine Elasmobranchs Angepasst

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Mutagenese und Analyse von genetischen Mutationen in den GC-reichen KISS1 Rezeptor-Sequenz in Menschen mit Fortpflanzungsstörungen Identified

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert

Whole Berg RNA Fluorescent

RNA