이 연구에 사용 된 인간의 종양 샘플 deidentified 되었고 인간의 연구에 대 한 로컬 윤리 지침에 따라 상용 소스 로부터 획득.
1. 샘플, 장비 및 시 약 준비
<ol><li>
FFPE 샘플 준비
	<ol>
<li>조직<ol>
<li>바로 다음 해 부, 조직 (두께에서 3-4 m m의 블록으로 절단) 10% 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) 실 온 (RT)에서 16-32 h에 대 한 수정 했다. 참고: 고정 시간 조직 유형 및 크기에 따라 달라 집니다.</li>
			<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 샘플을 세척 하 고 표준 에탄올 (EtOH) 시리즈를 사용 하 여 탈수 (70 %30-60 분, 80% EtOH 30-60 분, 90% EtOH 30-60 분, 95% EtOH 30-60 분, 3 x 100% EtOH EtOH 30-60 분) 뒤에 크 실 렌.</li>
			<li>6 표준 절차 사용 하 여 파라핀에 샘플을 포함 하 고 초과 파라핀을 제거 하는 데 필요한 파라핀 블록을 잘라. 참고: 블록 크기 조직 샘플 크기에 따라 다르지만 일반적인 크기는 0.75 0.75 인치2 x 또는 더 작은.</li>
		</ol>
</li>
		<li>셀 라인<ol>
<li>수집 하 고 특정 셀 라인에 대 한 권장 방법 셀을 펠 렛.</li>
			<li>회전자에 24 h에 대 한 RT에서 10% 포름알데히드에서 셀을 수정 합니다.</li>
			<li>Prewarmed 처리 젤에서 펠 릿으로 셀 준비 (예., Histogel). 얼음, parafilm의 조각에 젤 셀 펠 릿을 배치 하 여 공고히 펠 릿을 허용 하 고 Submerge 1 x PBS에 젤 셀 펠 릿 2-3 분 동안 앉아 보자.</li>
			<li>탈수 하 고 1.1.1 단계에서 설명한 대로 셀 펠 릿을 포함.</li>
		</ol>
</li>
		<li>섹션 준비<ol>
<li>포함 된 조직/세포는 톰을 사용 하 여 5 ± 1 μ m 섹션으로, 정전 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 잘라내어 실시간에 그들을 하룻밤 건조 참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 RT에 최대 3 개월 동안 건조에서.</li>
			<li>슬라이드 슬라이드 랙에 배치 하 고 분석 결과 수행 하기 전에 순환 공기 오븐 1 h를 위한 60 ° C에 탑재 된 조직 슬라이드를 구워. 참고: 슬라이드를 사용 하 여 즉시 또는 1 주일 방와 RT에 저장. 장기간된 보관 RNA 저하 될 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
장비 준비
	<ol>
<li>40 ° c 교 잡 오븐을 설정 철저 하 게 젖은 humidifying 종이 습도 제어 쟁반으로 어떤 잔여 dH2오 삽입 종이 제거 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 prewarm를 교 잡 오븐 트레이 삽입.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시 약 준비
	<ol>
<li>크 실 렌의 200 mL와 함께 에이전트 요리를 비운 2를 100%의 200 mL와 함께 두 개의 얼룩 요리를 채우기 EtOH 섹션의 deparaffinization를 위해 사용 될 것입니다.</li>
		<li>10 x 대상 검색 시 약 20 mL를 dH2O의 180 mL을 추가 하 여 상용 1 x 대상 검색 시 약 200ml를 준비 합니다. 기선에 두 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 대상 검색 시 약 x 1의 200 mL와 함께 한 슬라이드 홀더를 채워 다른 슬라이드 홀더 dH2오 열 200 mL 증기선을 사용 하 여 종 두 솔루션.</li>
		<li>40 ° c의 60ml를 희석 하 여 1 x 워시 버퍼의 10-20 분 준비 3 L에 대 한 따뜻한 50 x 워시 버퍼 prewarmed dH2O. 2.94 l 50 x 워시 버퍼</li>
		<li>증기 두건에서 dH2o.의 100 mL를 100 mL의 길의 되며 추가 하 여 솔루션 counterstaining 50% 길 되며 준비 증기 두건에서 dH2오의 250 mL를 28-30% 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 청소법 시 약 (0.02% (w/v) 암모니아 물)를 준비</li>
		<li>Prewarm 교 잡 조사 전에 10 분 동안 40 ° C에서 대상 프로브와 실시간 증폭 시 약 (앰프 0-6)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA 제자리에서 교 잡 시험
<ol><li>
Deparaffinization 및 탈수
	<ol>
<li>1.1.3.2 단계에서 설명한 대로 베이킹 후 (선택 사항 중지 포인트 1), 동요와 5 분 동안 크 실 렌에 섹션을 deparaffinize. 다시 5 분 Dehydrate 100%에 대 한 신선한 자일 렌에 deparaffinize 동요, 그리고 신선한 100%에서 다시 반복 2 분 EtOH EtOH 2 분.</li>
		<li>공기 순환 공기 오븐에서 60 ° C에서 5 분에 대 한 슬라이드를 건조 또는 RT에 때까지 완전히 건조 (옵션 중지 포인트 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 전처리
	<ol>
<li>내 인 성 과산화 효소 활동을 풀기 위해 RT에서 10 분에 대 한 준비-사용 수소 과산화물의 ~ 4 방울과 섹션을 품 어. 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다</li>
		<li>대상 검색 시 기선에 100 ° C에서 15-30 분의 200 mL와 함께 섹션을 품 어. 참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 대상 검색 종양 샘플을 셀 알 약 15 분 동안 수행 되었다.</li>
		<li>슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다, dH2O와 두 번 린스, 100%에서 찍어 EtOH 3 분을 슬라이드 또는 RT까지 완전히 순환 공기 오븐에서 60 ℃에서 건조에 대 한.</li>
		<li>소수 성 펜, 약 0.75 x 0.75 인치2를 사용 하 여 섹션 주위 소수 배리어를 그립니다. 참고: 그것은 작은 방 벽을 그리는 권장 하지 않습니다. 큰 섹션에 대 한 더 큰 방 벽을 그릴 수 필요 합니다.</li>
		<li>1 분 동안 완전히 말리 던 하룻밤 RT에 배리어를 하자 (옵션 중지 지점 3).</li>
		<li>슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 습도 제어 트레이에 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 각 슬라이드에 효소 III의 ~ 4 방울을 추가 하 고 단백질 소화에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 15-30 분 동안 그들을 품 어. 참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 효소 소화는 종양 샘플에 대 일 분 및 셀 펠 릿에 대 일 분 수행 되었다.</li>
		<li>슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로브 교 잡
	<ol>
<li>전체 섹션을 충당 하기 위해 적절 한 준비-사용 프로브 솔루션의 ~ 4 방울을 추가 합니다. 더 큰 섹션을 사용 하는 경우 추가 ~ 5-6 방울.</li>
		<li>교 잡 오븐에 40 ° C에서 2 시간에 대 한 프로브 교배 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 증폭
	<ol>
<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 0 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에서 2 분에 대 한 1 x 워시 버퍼의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 1 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 2 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 3 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 4 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 5 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 6 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 검출
	<ol>
<li>솔루션 작업 빠른 레드 염료를 준비 합니다. 0.75 x 0.75 인치2 배리어와 하나의 슬라이드에 대 한 추가 빠른 레드 B 염료의 2 μ 빠른의 120 μ 튜브와 잘 혼합에 레드-A. 참고: 소수 성 장벽 및 슬라이드 수의 크기에 따라 빠른 레드 작업 솔루션의 볼륨 달라 집니다.</li>
		<li>슬라이드에서 과잉 액체를 가만히 따르다와 슬라이드 솔루션 작업 빠른 레드 염료를 추가 합니다. 빛에 노출을 피하기 위해 커버와 함께 트레이에 RT에서 10 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 참고: 빠른 작업 준비, 5 분 이내 솔루션 레드를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 UV 빛에 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>레드 빠른 솔루션을 가만히 따르다와 린스 수돗물으로 두 번 슬라이드. 슬라이드 슬라이드 선반에 다시 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining
	<ol>
<li>Counterstain 실시간 세척에 2 분 50% 길 되며 솔루션 조직 섹션 수돗물으로 슬라이드 하 고 반복이 여러 번 슬라이드는 분명, 섹션 보라색 남아 때까지. 0.02% 암모니아 물 청소법으로 슬라이드를 찍어 (2-3 번 찍어). 암모니아 물 수돗물으로 교체 하 고 세척 슬라이드 3-5 시간.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 장착
	<ol>
<li>15 분 동안 60 ° C에 또는 RT까지 완전히 공기 순환 오븐에서 슬라이드 건조 건조. 각 섹션에 각 슬라이드 및 장소 coverslips에 장착 시 약 1-2 방울을 놓습니다. 공기 방울의 모든 트래핑을 하지 마십시오. 공기 건조 5 분 이상에 대 한 슬라이드. 참고: 빠른 레드 기판은 알코올에 민감한. 알코올에 슬라이드를 탈수 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시각화
	<ol>
<li>표준 명시 야 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+MET+via+diverse+exon+14+splicing+alterations+occurs+in+multiple+tumor+types+and+confers+clinical+sensitivity+to+MET+inhibitors.">Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.</a> Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).</li><li>Awad, M. 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모든 저자는 고급 셀 진단, 주식 회사에 의해 고용 되어

이 보고서에서 소설 틱 분석 결과 프로토콜 및 응용 세부 사항에서 토론 되었다. 분석 결과 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스 및 조직 컨텍스트에서 점 돌연변이의 직접적인 시각화 수 있습니다. 분석 결과 RNAscope 기술5 기반 이며 따라서 단일 분자 검출 가능 합니다. 그러나, 때문에 고급 증폭 시스템 신호 감지할 수 있습니다 조금 한 더블 Z 쌍이 들어 있는 프로브 또는 그냥 50 뉴클레오티드의 대상 서식 파일 길이. 프로브 길이에서 단일 더블 Z로 짧은 있을 수 있습니다, 때문에 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스, 점 돌연변이 (표 1)의 검출에 대 한 수 있습니다.
분석 결과의 성공적인 성능에 대 한 여러 기술 권장 있다. 첫째, 조직 16-32 h10에 대 한 상 온에서 신선한 10% 중립 버퍼링 말린 (NBF)에 고정 되어야 한다. Underfixation (< 16 h) 또는 overfixation (> 32 h) 분석 결과의 성능에 악영향을 줄 것 이다 고 추가 최적화 필요할 수 있습니다. 둘째, 강력한 프로브 교 잡 및 신호 증폭에 필요한 온도 습도의 최적 제어를 보장 하기 위해 처리 시스템 및 교 잡 오븐 슬라이드 사용 해야 프로토콜 단계 5 2.3 (protease 전처리, 프로브 교 잡, 신호 증폭, 및 신호 감지). 셋째, 초과 잔여 버퍼 프로토콜을 통해 각 단계 전에 제대로 decanted (하지만 너무 많은 조직 섹션 건조 되도록) 해야 합니다. 슬라이드 밖으로 건조, 중요 한 일반적인 신호 개발할 것입니다. 넷째, 조직의 종류에 따라 전처리 최적화 할 수 있습니다. 잘못 된 프로 테아 제를 사용 하 여 또는 시간의 차선의 길이 대 한 발생할 수 있는 아래-또는 오버-digestion 그리고 신호에 부정적인 영향을 미칠 것 이다. 마지막으로, 그것은 항상 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 테스트 프로브와 함께 실행 하는 것이 중요입니다. 네거티브 제어 프로브는 샘플에서 RNA 품질을 테스트 조사 결과 해석에 대 한 최적의 그 배경 신호, 그리고 긍정적인 통제 조사 분석 결과 올바르게 완료 되었습니다 확인 합니다. 경우의 긍정적인 제어 프로브 신호 샘플에서 RNA 품질 높습니다 차선 및 신호 테스트 프로브 볼 수 없습니다 수 있습니다.
수동 분석 결과 이외에 자동화 된 stainers에 분석 결과 수행 하는 능력은 또한 시연된 (그림 6). 이 자동화 된 분 분석 결과 수익률 높은 신호 대 잡음 비율 및 표 1;와 같이 동일한 응용 프로그램에 대 한 적용 그러나, 자동화 된 분석 결과의 혜택 분석 결과 조건, 간 사용자 가변성 및 실습 시간의 최소화의 표준화를 포함 하 고 신뢰할 수 있는 방식으로 조직 샘플의 높은 처리량 검열에 대 한 수당.
Immunohistochemistry (IHC)와 qRT-PCR FFPE 임상 표본에서 결합 이체 (특히 EGFRvIII)의 검출에 대 한 허용, 이러한 기술은 필요한 특이성 부족 수 고는 결합의 공간 해상도에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 변형 식, 각각11,12. 이 프로토콜에 분석 결과의 주요 장점은 형태학 상 조직 컨텍스트를 유지 하면서 스플라이스 연결의 그것의 높게 과민 하 고 특정 시각화 이다. 여기, 분석 결과 능력을 정확 하 게 METΔ14, EGFRvIII 등 여러 스플라이스 변종에 대 한 독특한 exon 접합 대상 시연 (그림 3과 6) 했다. 또한, 분석 결과 전립선 암, 뇌, ErbB4의 여러 개의 isoforms 및 원형 RNA Cdr1as 마우스 뇌3,,1314의 녹아웃의 확인 스플라이스 변종 아칸소-v 7을 감지 하 보였다.
이 분 분석 결과 의해 짧은 대상 시퀀스 검출 CDR3 시퀀스 Jurkat 세포 (그림 3)에서 파생 된의 탐지에 의해 증명으로 짧은 길이, 50 뉴클레오티드 RNA 시퀀스의 시각화에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 또한 Revêchon 외와 같이 매우 다른 가족 구성원 또는 종, 동종은 유전자 시퀀스를 검색할 수 있습니다., 누가 마우스 피하 흰색 adipose 조직15에서 표현 하는 인간의 progerin를 검출 하기 위하여 짧은 대상 분석 결과 사용. 또한, 작은 nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR 중재 하는 유전자, 편집과 전조 예측에 관한 발견 현장에 짧은 대상 분석 결과 함께 될 수 있습니다. 더 최근에, 푸 외 IHC 표현 사전-미르 mir125b16망막에 정확한 셀을 식별 하기 위해이 분 분석 결과 결합.
종양에 프로 파일링 하는 돌연변이 종양의 진행을 공부 하 고 표적으로 한 치료를 개발 중요 합니다. 돌연변이 프로 파일링 하는 것은 높은 처리량 시퀀싱을 통해 달성 될 수 있다,이 기술은 intratumoral 이종 또는 링크 유전 변경 세포 형태학17,18로 다루는 완전히 수 없습니다. 점 돌연변이이 분 분석 결과 사용 하 여 검색 셀 라인 (그림 5)에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 탐지에 의해 검증으로 단일 기본 해상도에서 RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 한 수 있습니다. 또한, 베이커 외. 대 장 암18에서 BRAF, KRA, 및 PIK3CA oncogenes에 여러 돌연변이 대상으로 점 돌연변이 분석 결과 사용 합니다. 그들은 식별 하 고 공간적으로 종양 세포, 궁극적으로 그들은 내 종양이 질에 어떻게 공헌 하는지 보여주는의 드문 돌연변이 subclones를 지도 했다.
요약 하자면, 전문화 된 RNA 분 분석 결과 개발 되었습니다. 이 방법론은 스플라이스 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 제자리에변이의 탐지에 대 한 수 있습니다. 그것은 민감한, 정량, 구체적이 고 적응력이 성능 모두 수동 방법으로 자동화 된 stainers 에입니다.

Microarrays, 다음-gen RNA 시퀀싱 (RNAseq) 등 높은 처리량 transcriptomic 기술 등 다양 한 질병에 대 한 진단, 예 후, 그리고 예측 임상 가치와 RNA 마커의 발견 향상 기 하 급수적으로 암1,2. 이러한 바이오 마커의 정밀 의학에서의 사용을, 높은 있다 RNA 생체 조직의 컨텍스트 내에서 임상 샘플을 측정할 수 있는 표준화 된 하 고 강력한 기술에 대 한 필요. 널리 설립 RNAseq 등 양적 RT-PCR 분석 실험 갈기 바인딩 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현, 하는 동안 필요한 조직 균질 및 RNA 격리 의미 vivo에서 세포 형 특이성의 손실 및 형태학 정보3. 기존의 현장에서 RNA 검출 방법론 부족 감도 특이성 희귀 또는 낮은 표현 RNA 생체 조직 컨텍스트4내에서 안정적으로 측정 하는 데 필요한.
상업 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 (예., RNAscope 분석 결과)은 이러한 태 클은 한 기술 도전과 300 보다 큰 단일 RNA 분자의 높게 과민 하 고 특정 시각화를 해줍니다 컨텍스트 내에서 조직 형태학의 뉴클레오티드 이러한 유형의 분석 결과 약 6-20 더블 Z 프로브 쌍 함께 고급 하이브리드 기반 신호 증폭5의 독특한 oligonucleotide 조사 디자인을 사용 합니다.
이 연구는 특수 RNA 분 분석 결과를, BaseScope, 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있는 이전에 디자인 상업 기술 보완에 대해 설명 합니다. 이 분석 결과 transcriptome의 복잡 한 복잡성을 해결 하 고 exon 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 조금 한 더블 Z 프로브 쌍을 사용 하 여 조직 컨텍스트 (표 1)에서 점 돌연변이의 정확한 탐지를 위해 적용 가능 하다. 이 보고서는 완전 한 분석 결과 프로토콜과 결합 이체, T 세포 수용 체 클론 CDR3 시퀀스의 검출에 사용 및 고 FFPE에 단일 염기 돌연변이 세포 선 및 종양 조직.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

정밀 의학 생체의 정확한 탐지에 매우 의존 때문에, RNA 생체에서 현장에서 임상 표본에서 측정 표준화 하 고 강력한 기술 위한 증가 필요가 있다. 갈기 바인딩 분석 RNAseq 같은 양적 RT-PCR 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현 하는 동안 그들은 또한 RNA 추출 필요 하 고 따라서 형태학 조직 컨텍스트 내에서 귀중 한 식 분석을 방지 합니다. 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 여기에 설명 된 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 단일 세포 수준에서 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있습니다. 이 분석 결과 이전 개발된 상업 분석 결과를 보완 하 고 스플라이스 변종, 짧은 목표와 조직 내의 점 돌연변이의 과민 하 고 특정 위치에서 검색을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 프로브 2 개의 임상으로 중요 한 결합 이체, EGFRvIII 및 METΔ14에 대 한 독특한 exon 접합을 대상으로 설계 되었다. 짧은 대상 시퀀스의 탐지는 T 세포 수용 체 α와 β Jurkat T-셀 라인의 CDR3 시퀀스의 특정 감지에 의해 시연 했다. 자동화 된 얼룩을 사용 하 여 셀 라인에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 시각화를 통해 단일 뉴클레오티드 해상도 (점 돌연변이) RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 일 분 분석 결과의 유틸리티는 또한 표시 플랫폼입니다. 요약 하자면, 프로토콜 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 돌연변이 제자리에 수동 성능에 대 한 자동화 된 stainers에의 탐지를 가능 하 게 전문화 된 RNA 분 분석 결과를 보여줍니다.

현장에서 교 잡 시험 워크플로: 흐름과 그림 1 에 표시 된 4 개의 부분으로 구성 됩니다: permeabilization 셀 이나 조직 대상 검색 및 효소 솔루션, 대상 RNA, 프로브의 교 잡의 신호 증폭, 및 신호의 시각화. 신호 수 있습니다 또한 측정할 수 디지털 이미징 소프트웨어 시스템을 사용 하 여 또는 반 양적으로 셀 당 도트 수에 따라. 그림 2 에 설명 된 수동 절차 또한 완전히 상업적인 자동 염색 시스템에 자동 되었습니다.
Exon 접합 탐지 (EGFRvIII 스플라이스 변형)에 대 한 대표적인 얼룩: EGFRvIII constitutively 활성 종양 신호7로 이어지는 exons 7, 2의 프레임에 게놈 삭제에서 발생 하는 상피 성장 인자 수용 체의 변종 이다 . 분석 결과 FFPE 세포종 (GBM) 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 식별 하기 위해 사용 되었다. 단일 이중 Z 프로브 중 WT를 검출 하기 위하여 exon 연결 되도록 설계 되었습니다 돌연변이, 또는 두 사본 (그림 3A). EGFRvIII 전용 프로브 스팬 1과 8 (E1/E8) exons의 동안 WT EGFR 프로브 exons 1과 2 (E1/E2) 또는 exons 7과 8 (E7/E8)의 접속점 스팬. 8, 9 (E8/E9) exons의 교차점에 걸쳐 일반적인 프로브도 총 EGFR (WT와 EGFRvIII 증명서)를 검출 하 사용 되었다. 모든 감지기 했다 다음 FFPE GBM 샘플에서 EGFR 상태를 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 3B 에 표시 된 두 개의 대표적인 예는 더 큰 연구에서 촬영 됐다. EGFR 상태는 독립적인 방법, RT-PCR에 의해 확인 되었다. 두 WT 프로브는 두 샘플 WT EGFR (그림 3B) 익스프레스 나타내는 두 샘플에서 신호를 감지. 그러나, 돌연변이 프로브만 EGFRvIII + 샘플,이 샘플은 실제로 EGFRvIII 변종 (그림 3B, 왼쪽된 패널)에 대 한 긍정적인 확인 신호 감지를 보여주었다. 반대로, 돌연변이 프로브 EGFRvIII-샘플 (그림 3B, 오른쪽 패널)에서 신호를 검색 하지 못했습니다. 함께 찍은, 이러한 결과 exon 접합 분석 결과 GBM FFPE 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 확인할 수 있습니다 보여 줍니다.
짧은 목표를 위해 얼룩이 지기 대표: CDR3, 또는 보완 결정 지역 3, T-세포 수용 체에 높은 변수 도메인입니다. 일반적으로, CDR3 시퀀스는 아주 짧은; 예를 들어 Jurkat T-셀 라인에서 CDR3 α와 β 시퀀스는 길이, 51 및 48 뉴클레오티드 각각 (그림 4A). Jurkat 세포, CDR3 센스 조사에에서 표현 된 특정 CDR 시퀀스를 식별 하 α와 β Jurkat T 세포에 표현 되는 생성 된, 감각 CDR3 조사 이외에 α와 β로 부정적인 제어 프로브. 모든 프로브 다음 분석 결과 함께 준비 하는 FFPE Jurkat 세포에서 테스트 되었습니다. 관찰 되었다 강력한 얼룩 방지 감지 프로브 두 CDR3에 대 한 α 및 β Jurkat 세포에 감지 프로브 반면 감지 더 작은 신호 (그림 4B). 이러한 결과 T 세포 수용 체의 클론에 대 한 매우 다양 하지만 짧은 CDR 시퀀스 간의 분별 짧은 대상 분석 결과 수를 보여 줍니다.
대표 지점 돌연변이 EGFR L858R에 대 한 얼룩: 점 돌연변이 프로브 종양 컨텍스트에서 단일 염기 변이 및 작은 삽입 또는 삭제 (INDELs) 검출 하기 위하여 개발 되었다. 그림 5A 는 제자리에서 점 돌연변이 EGFR L858R의 감지 능력을 보여 줍니다 (2573T > G). 2 프로브 설계 되었습니다: 하나는 L858R 검출 돌연변이 EGFR 시퀀스와 EGFR L858 WT 시퀀스를 감지. 두 프로브 두 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다:만 표현 하는 EGFR L858 WT; H2229 그리고는 EGFR L858R 돌연변이 heterozygous H1975. L858R 돌연변이 프로브만 H1975 셀 라인 H2229 셀 라인에만 신호를 감지. 그러나, WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지합니다. 마찬가지로, 제자리에서 점 돌연변이 KRA G12A의 탐지를 시각화 그림 5B (35 G > C). 2 프로브 KRA G12A 산 및 KRA G12 WT 시퀀스를 감지 하도록 설계 되었고 HuT78 셀 라인 (이 표현 하는 KRA G12 WT)와 (는 KRA G12A 돌연변이 heterozygous) SW116 셀 라인에서 테스트. KRA G12 WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지 하는 동안 KRA G12A 프로브만 SW116 셀 라인에 신호 감지. 함께 찍은, 이러한 데이터는 세포 및 조직 맥락에서 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 검출에서 점 돌연변이 분석 결과의 기술적 능력을 보여 줍니다.
대표 자동 제자리에 분석 결과 대 한 얼룩: 자동화 된 분석 실험 허용 샘플의 더 많은 수 더 안정적으로 실행 되도록 간 사용자 가변성 및 실습 시간을 최소화 하 고 일관 되 게 재현할 결과 생성 합니다. 따라서, 분석 결과의 자동된 버전은 개발 되었다. 이 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩이 보여, 스플라이스 변종 METΔ14의 탐지는 시험 되었다. 이 이체는 사전-mRNA 접합, 제정 활성화, 메트로 수용 체8,9의 종양 변환 하는 동안 생략 되 고 메트로 유전자에서 exon 14의 결과. 특히 METΔ14 변종 감지, 2 개의 exon 접합 프로브 설계 되었습니다: exons 13 및 15 (E13/E15) METΔ14 변형 사본을 감지 하의 걸쳐와 exons 14 및 15 (E14/E15) WT 만난 감지 하의 걸쳐 대 본 (그림 6A)입니다. 두 프로브 다음 2 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다: METΔ14 변종 표현, H596 및 A549, WT 만난 유전자 표현. 두 프로브 E13/E15 프로브만 H596 세포와만 (그림 6B 와 6 C) A549 세포에서 신호를 감지 E14/E15 프로브에 신호를 감지 상호 배타적 표현 패턴을 보였다. 마지막으로, dapB에 대 한 조사 (그림 6B 와 6 C) 배경 신호를 나타내는 아무 신호를 보여주었다. 전반적으로,이 데이터는 메트로 변형 METΔ14에 현장에서 자동된 BaseScope 분석 결과 활용 하 여 특정 검색을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> 그림 1 : 분석 결과 워크플로. 워크플로 4 주요 단계로 구성 됩니다: 전처리 permeabilize 세포 또는 조직, 대상 RNA, 교 잡 조사를 증폭, 신호 및 명시 또는 형광 현미경 시각화 하 여 탐지 신호. 개별 점 디지털 이미지 분석 플랫폼을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> 그림 2 : 수동 분석 결과 프로토콜의 그림. 전체 분석 결과 9 h. 전처리 보육 시간에 대하여 조직 전처리 권고에 대 한 사용자 설명서의 부록 A를 참조 하는 것이 좋습니다 그래서 번 조직 유형에 따라 다를 수 있습니다에 완료할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> 그림 3 : 엑손 접합 탐지의 대표 이미지. (A) 표시 여기는 EGFR WT 및 EGFRvIII 내용은 exon 기구 EGFR WT 또는 EGFRvIII 교차점에 걸쳐져 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도. (B)는 exon 접합 분석 결과 긍정적인 제어 프로브, POLR2A, 및 부정적인 제어 프로브, dapB 뿐만 아니라 (A)에 나열 된 프로브를 사용 하 여 두 FFPE 세포종 샘플에서 수행 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> 그림 4 : 짧은 대상의 대표 이미지 시퀀스 검색. (A) 표시 여기는 Jurkat 세포 CDR3 시퀀스. 블랙에 시퀀스 측면에 서 일반적인 순서 이며 빨간색에서 순서는 CDR3α 또는 CDR3β에. 단일 이중 Z 짧은 대상 시퀀스 프로브가이 시퀀스에 대 한 설계 되었습니다. (B) 짧은 대상 분석 결과 Jurkat 세포 (a), 시퀀스를 대상으로 하는 안티 감각 또는 감각 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행한 그리고 dapB 부정적인 제어로 사용 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> 그림 5 : 점 돌연변이 탐지의 대표 이미지. (A) 분석 결과 H2229 세포 (EGFR L858 homozygous)와 H1975 세포 (EGFR L858R 돌연변이 heterozygous) EGFR L858 WT 시퀀스 또는 EGFR L858R를 대상으로 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에서 수행 되었다 변이 된 시퀀스입니다. (B) 점 돌연변이 분석 결과 HuT78 셀 (KRA G12A homozygous) 및 SW116 셀 (KRA G12A 돌연변이 heterozygous) KRA G12 WT 시퀀스를 대상으로 하는 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다 또는 KRA G12A 돌연변이 시퀀스입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> 그림 6 : 엑손 접합 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩의 대표 이미지. (A) 표시 여기 만난 WT 및 METΔ14 성적표와 만난 WT 또는 METΔ14 교차점에 걸쳐져 단일 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도 exon 조직입니다. (B) (C) 자동화 된 exon 접합 분석 결과 부정적인 제어 프로브 dapB 뿐만 아니라 H596 셀 (METΔ14 표현)와 A549 세포 (만난 WT 표현) (A)에 나열 된 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exon 접합</td>
			<td>짧은 시퀀스</td>
			<td>점 돌연변이</td>
		</tr>
<tr>
<td>변형/isoform를 결합</td>
			<td>50 및 300 nt 사이 시퀀스</td>
			<td>점 돌연변이</td>
		</tr>
<tr>
<td>원형 RNA (circRNA)</td>
			<td>높은 동종 시퀀스</td>
			<td>짧은 indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>유전자 융해</td>
			<td>TCR 클론 CDR3 시퀀스</td>
			<td>편집 진</td>
		</tr>
<tr>
<td>유전자 녹아웃 (KO)</td>
			<td>사전-미르</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>작은 nucleolar RNA (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>편집 진</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 응용 프로그램은 제자리에서 분석 결과. 이 분석 결과의 응용 프로그램에 대 한 3 주요 종류가 있다: 엑손 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 점 돌연변이. 각 열에 나열 된 각 범주에 대 한 몇 가지 특정 응용 프로그램 예입니다.

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Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

10.5K 조회수.  Advanced Cell Diagnostics, Inc. 여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

칙의 배아에서 신경 유도에 대한 분석

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in adulthood 1,2,3. Inactivating mutations in KISS1R identified in patients have been associated with iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2 and precocious puberty 4. Functional studies of these mutants are crucial for our understanding of the mechanisms underlying the regulation of reproduction by this receptor as well as those shaping the disease outcomes, which result from abnormal KISS1R signaling and function. However, the highly GC-rich sequence of the KISS1R gene makes it rather difficult to introduce mutations or amplify the gene encoding this receptor by PCR.
Here we describe a method to introduce mutations of interest into this highly GC-rich sequence that has been used successfully to generate over a dozen KISS1R mutants in our laboratory. We have optimized the PCR conditions to facilitate the amplification of a range of KISS1R mutants that include substitutions, deletions or insertions in the KISS1R sequence. The addition of a PCR enhancer solution, as well as of a small percentage of DMSO were especially helpful to improve amplification. This optimized procedure may be useful for other GC-rich templates as well.
The expression vector encoding the KISS1R is been used to characterize signaling and function of this receptor in order to understand how mutations may change KISS1R function and lead to the associated reproductive phenotypes. Accordingly, potential applications of KISS1R mutants generated by site-directed mutagenesis can be illustrated by many studies 1,4,5,6,7,8. As an example, the gain-of-function mutation in the KISS1R (Arg386Pro), which is associated with precocious puberty, has been shown to prolong responsiveness of the receptor to ligand stimulation 4 as well as to alter the rate of degradation of KISS1R 9. Interestingly, our studies indicate that KISS1R is degraded by the proteasome, as opposed to the classic lysosomal degradation described for most G protein-coupled receptors 9. In the example presented here, degradation of the KISS1R is investigated in Human Embryonic Kidney Cells (HEK-293) transiently expressing Myc-tagged KISS1R (MycKISS1R) and treated with proteasome or lysosome inhibitors. Cell lysates are immunoprecipitated using an agarose-conjugated anti-myc antibody followed by western blot analysis. Detection and quantification of MycKISS1R on blots is performed using the LI-COR Odyssey Infrared System. This approach may be useful in the study of the degradation of other proteins of interest as well.

Mutations in the kisspeptin receptor (KISS1R) are associated with reproductive disorders in patients. Here we describe how to introduce mutations of interest in the GC-rich sequence of KISS1R as well as the use of KISS1R constructs to characterize the degradation pathway of the receptor by immunoprecipitation and western blot.

생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; 현장에서</em전체 마운트 태아 및 세포 조직학에서&gt; 하이브리드는 해양 Elasmobranchs을위한 적응

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...