この方法は、ショウジョウバエメラノガスター中枢神経系の電気発生を測定することによって、昆虫毒物学および昆虫生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これにより、幅広い科学的仮説をテストし、新しい殺虫剤モードの発見を支援することができます。この技術の主な利点は、ショウジョウバエの神経系を研究するための最小限の財務入力で、シンプルで再現性の高い、比較的高スループットなシステムを提供することです。
開始するには、取得/解析ソフトウェアを開きます。メイン ツールバーの [設定] をクリックし、[チャネル設定] を選択すると、ダイアログ ボックスが開きます。合計チャネル数を 3 に減らします。
チャンネル1は、100ミリボルトの範囲でアンプからの生信号を記録します。チャネル 2 は、指定されたしきい値を超えるチャネル 1 からのイベント数をカウントするために使用されます。この場合は、[計算]タブをクリックして、チャンネル2のドロップダウンメニューを開きます。
2 番目のダイアログ ボックスを開く[周期的測定]を選択します。ソースとしてチャネル 1 を選択します。次に、ドロップダウン メニューの測定で、[イベントでのユニット スパイク] を選択します。
最後に、検出設定領域のドロップダウン メニューから[単純なしきい値]を選択します。閾値レベルは、バックグラウンドノイズの上に設定される検出調整ウィンドウに入力されます。電気的活動をヘルツで表現されたレートプロットに変換するには、3番目のチャンネルで[算術]を選択します。
新しいウィンドウで、1000 回の smoothsec を入力し、括弧チャネル 2 つのコンマ 2。次に、単位ドロップダウンメニューで周波数単位ヘルツを選択します。ダイアログ ボックスを閉じて、メイン画面に戻ります。
チャネル 3 の y 軸は、ヘルツと X 軸で時間単位で表す必要があります。幼虫ショウジョウバエCNSを分解し、まず培養バイアルからさまよう第3インスターショウジョウバエメラノガスターを同定して抽出し、生理食塩水の200マイクロリットルに入れる。次に、一対の細い鉗子で口のフックをつかみ、軽い圧力でウジの腹部を軽い圧力でつかみ、細いカチクラ層を引き裂かないようにする。
口のフックと腹部を異なる方向にそっと引っ張り、ウジの尾端を頭の領域から分離し、ウジの内臓を露出させます。CNSは気管および消化管と絡み合う。消化管からCNSをいじめ、鉗子で気管を出します。
ウジからのショウジョウバエ中枢神経系の解剖は、成功のための重要なステップです。解剖された神経節は、下降運動神経に大きな損傷を与えることなく、そのままでなければなりません。神経節に付着する運動神経の数が多いほど、ベースライン発火頻度が増加します。
必要に応じて、VANNASスプリングハサミで脳ローブにCNS後部を手動でトランセクトすることによって、血液脳関門を破壊する。トランセクションは、使用されている化学物質の物理化学的特性に基づいて行われるべきです.赤い線は、提案された切除点と、ここに示す無傷の下降末梢神経幹を有するトランセクトCNSである。
まず、まず、ガラスピペット電極をホウケイ酸ガラス毛細血管から5~15メガオームの抵抗に引き出します。200マイクロリットルの生理食塩水を含むワックスチャンバにトランセクトされたCNSを挿入します。コーティングされていない昆虫ピンを、アース線にはんだ付けしたワニクリップでクランプし、そのピンを生理音に挿入して回路を完成させます。
マイクロマニピュレータを使用して、電極をトランセクトされたCNSの尾端に向けます。末梢神経幹を接続する前に、取得/解析ソフトウェアの閾値レベルを調整して、バックグラウンドノイズを除去します。注射器にわずかな負圧を加え、末梢神経を吸引電極に引き込む。
データ取得ソフトウェアで記録を開始し、ベースライン発射速度を5分間平衡化してから、ベースライン発射率データを収集します。5分後、200マイクロリットルの生理食塩水と車両を加え、チャンバーの総容積を400マイクロリットルに引き上げ、制御焼成率の記録を開始します。制御処理の焼成のパターンが、ここで示した例と類似しない場合は、調製および記録を廃棄する。
3~5分間の記録後にベースラインが確立されたら、200マイクロリットルの生理食塩水を引き出し、生理食塩水に可溶化した実験剤の200マイクロリットルを添加する。薬と最終濃度を含むコメントを含めることによって取得/分析ソフトウェアで薬物アプリケーションのこの時点をラベル付け.ここに示されている代表的な神経排出トレース DMSO への曝露前後.
矢印は、アプリケーションの時間を示します。DMSO に対する応答が制限されています。プロポククサウルスの増加用量は、血中切除ショウジョウバエCNSのスパイク放電頻度を濃度依存的に増幅し、一方、神経抑制剤GABAは濃度依存的にスパイク放電頻度を減少させた。
この手順を試みる間、それはex vivo実験であり、したがって、pHや温度などの生理食物の条件は、中枢神経系の準備の長期活動のために重要であることを覚えておくことが重要です。同様に、無関係な電気的活動の欠如、効果的なファラデーケージ、および60ヘルツノイズの低減は、このアッセイの成功にとって重要です。このアッセイを通じて収集されたデータは、殺虫剤の特定の作用様式を特定するのに役立ちます。
電圧クランプ電気生理学、生化学的分析、追加の薬理アッセイなどの他の方法を通じてこれらのデータのその後の検証を行うことができます。
