この作品は、健康グラントGM094246、米国心臓協会グラント11GRNT7890004、国立科学財団助成MCB-1110501の国立研究所によってサポートされていました。

1目的のタンパク質を含む構築を作成適当なベクターに目的のタンパク質を発現する遺伝子をクローニングします。彼らは、HEK293およびCHO細胞のような哺乳動物系における発現のために非常に適しているなどのpcDNAシリーズやのpRK5などのベクターを使用してください。 フルオロフォアでタグ付けするために、タンパク質上のサイトを選択します<ol><li>タンパク質内の可能なコンホメーション変化を反映することができますラベリングサイトを選択してください。可能な場合は、この決定を行う手助けするタンパク質または相同タンパク質の結晶構造を使用する。利用可能な結晶構造が存在しない場合、タンパク質の可能な構造を予測するので、適切な部位への洞察を受け取るためのオンラインソフトウェアを使用する。 </li><li>タンパク質を標識することができるように、選択された残基の側鎖は表面に露出し、フルオロフォアにアクセス可能であるような残基を選択する。 <ol><li>その残留物を選択してくださいリガンド結合に関与しない例サイトの、タンパク質の機能にとって重要ではない。 </li><li>システイン変異を導入することで、タンパク質構造に最小限の摂動を引き起こすこと、例えばセリン、類似している部位に優先権を与える。 </li><li>ラベリングサイトを選択した後、タンパク質はこれらのみ意図されたサイトからのLRETを与えることを確実にするために突然変異を作る。離れた潜在的にマレイミド結合体化するために蛍光タグを結合することができた非ジスルフィド結合システインを変異させる標準的な部位特異的変異誘発プロトコルを使用してください。これらは、タンパク質の折り畳み形状の蛍光色素と反応してはならないので、離れてジスルフィド結合のシステインと埋め込み、遊離システインを変異しないでください。 </li></ol></li><li>標準的な部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて点変異を作製することにより、所望の部位でのシステイン残基を導入する。 </li><li>特にタンパク質からシステインの1を切断することができ、プロテアーゼ切断部位を含めます。場合それは、保守的（認識配列はLVPRGS）またはトロンビンを有するように、タンパク質を突然変異させることによって部位を導入するためにタンパク質配列が可能Xa因子（認識配列IDGRまたはIEGR）導入されたシステイン周辺の配列およびプロテアーゼ切断するためにアクセス;さもなければテトラ - またはヘキサ - ペプチド配列は、全体として挿入することができる。導入されたシステインの開裂一つは、タンパク質中の特定のケースの他の部分から解離すると、これが変異システインに隣接する2つの切断部位を必要とすることができるように、サイトを選択してください。 </li></ol> 3試験タンパク質の発現と機能<ol><li>突然変異したタンパク質の発現を確認するためにウエスタンブロットを実行します。 </li><li>全然、機能不全のタンパク質の立体構造変化を研究避けるためにも、変異は最小限しかタンパク質の機能を変更したことを確認するために、タンパク質の機能アッセイを実行します。 注：全てのタンパク質は、異なる機能を有するので、単一のfは存在しない<html> LRETのために特別に使用されているunctionalアッセイ;しかしながら、機能的アッセイのいくつかの例は、イオンチャネルのための酵素、受容体に対するリガンド結合アッセイおよび電気生理学的研究のための酵素活性アッセイが含まれる。 </li></ol> 4、使用するフルオロフォアを選択範囲は、フルオロフォアペアの0 R 0.5-1xとの間にあるように測定されている予想される距離範囲に基づいて蛍光団を選択します。 注：これは一般的にはるかに長い寿命を持つ背景、より容易に減算することができます。測定中の予想される距離範囲は約35オングストロームである場合は、このペアに対するR 0は 53 A（ 表1）であるため、例えば、使用する適切なフルオロフォアペアは、アクセプターとしてドナーおよびAlexa 594などのテルビウムキレートであろう。 5。一過哺乳動物細胞の必要量をトランスフェクションすることにより、プロテインエクスプレスntent &quot;&gt;一過、典型的には、共通のトランスフェクション試薬のいずれかを用いて選択された哺乳動物細胞に関心対象のタンパク質をトランスフェクトHEKおよびCHO細胞株についてLRET実験ごとに4つの10cmディッシュを使用しているが、この量は、タンパク質の発現に依存して変化し得る、安定性、 等 。細胞は、収穫前に36〜48時間、タンパク質を発現するようにします。 6タンパク質を標識<ol><li>培養皿から細胞を切り離します。単純に皿の底に対する緩衝ピペッティングしてHEK細胞を切り離します。細胞外の緩衝液を用いてメディアを洗い流し、細胞スクレーパーでCHO細胞を切り離します。 </li><li> 3分間の1100×gでの遠心分離によって細胞を回収します。標識後だけでなく、その後の洗浄の後に細胞を収集するためにこれらの同じ遠心機の設定を使用してください。 </li><li>その後100〜300 nMの最終濃度までの等モル量でドナーとアクセプターフルオロフォアを追加、細胞外液3ml中の細胞を一時停止します。回転子fにインキュベートまたはRTで1時間。 </li><li> LRET測定のための細胞外緩衝液（通常2ml）にこれらの細胞を懸濁その後、未結合の蛍光団を除去し、細胞外緩衝液を用いて、これらの標識された細胞を3〜4倍洗う。 </li><li>対照として、いずれかのアクセプターフルオロフォアを添加せずにのみドナー·フルオロフォア（テルビウムキレート）を用いた細胞の別のセットにラベルを付ける。 注：これらのドナーのみの実験からのデータは、分析を完了するために必要である。これらの実験は、同一または異なる日に行うことができる。 </li><li>ラベリング処理も標識に用いられる部位に応じて機能を妨害する可能性がある場合も、標識された変異体タンパク質と、今回の機能検証を行う。 注：これらの実験は、同一または異なる日に行うことができる。 </li></ol> 7。LRET実験をセットアップします<ol><li> 1ミリリットルの最小容積の石英キュベット中の懸濁した細胞を配置します。 </li><li>コンピューターと機器の電源をオンにし、DATのパラメータを調整それに応じて取得プログラム。 <ol><li>ドナーフルオロフォア（テルビウムキレートに適していますnmの330から340）の吸光度の範囲に励起波長を設定します。 </li><li>アクセプター発光を使用アクセプタに基づいて変化していることを念頭に置いて、適切に発光波長を設定します。重要なことは、唯一のアクセプター発光を測定し、いずれのブリードスルードナーの放出から含まれていません検出波長を選択します。例えば、アクセプタ表1のようにアレクサ555用の565ナノメートルの波長を使用しています。タンパク質は唯一のドナーであるが、アクセプタずに標識したドナーのみ ​​の測定のために、テルビウムキレートの排出を測定するための波長545nmを使用しています。 </li><li>長寿命部品を逃しされないことを確実にするための少なくとも3倍と予想LRET寿命であることが発光検出の長さを設定します。 </li></ol></li><li>スキャンを実行します。結果の一貫性を確保するために、99スイープの少なくとも3つのスキャンを行います。番目の保存テキスト·ファイル（* .txt）など、電子結果。 </li><li> （そのようなリガンドの添加のような）異なる条件に関して、タンパク質の立体構造変化を測定するには、それらの条件を変更して、再度、この新しい条件の下で同じ試料について99スイープそれぞれの少なくとも3つのスキャンを実行します。グルタミン酸受容体の立体配座に対するグルタミン酸の影響を研究した場合、例えば、ステップ7.3でスキャン同じサンプルに1 mMのグルタミン酸を追加してから、もう一度スキャンします。 </li><li>適切なプロテアーゼの5台まで追加して、切断が完了し、これ以上の変更は三つの連続スキャンの一生の間に見られなくなるまで継続的にスキャンしてください。通常、切断は、2〜3時間で完了します。第Xa因子切断部位は、プロテアーゼ切断に使用されている場合、例えば、試料に第Xa因子の3μlを添加し、3時間30分毎に走査する。 </li></ol> 8。得られたデータを分析します<ol><li>データ解析ソフトウェアを開きます。 </li><li>蛍光寿命をロードテキストフ​​ァイルを開くために、インポートASCIIを使用してデータ。一つのファイルに、すべての複製だけでなく、最終的なバックグラウンドの測定値をロードします。 </li><li>最終的なデータを取得するために、各実験条件についてすべてのスキャンからのデータを平均化。そのためには、個別の臨床試験を含む列を強調表示し、メニューバーの[データ]メニューの下に、臨床試験からの平均蛍光強度だけでなく、標準偏差と標準誤差を表示する行に統計をクリックしてください。 </li><li>アクセプターの増感発光の寿命を表す曲線を作成するためのX軸上のマイクロY軸および寿命に蛍光強度線グラフとして平均値をプロット。データのより良い視覚化を可能にするために、対数スケールにプロットのY軸を変更します。 </li><li>完全な切断を示す重複を示し、最終的なスキャンを平均バックグラウンド測定データ上の手順を繰り返し8.3。 </li><li>上の平均バックグラウンドデータを表示します平均化された生データを含む同じプロット。そのためには、プロットメニューの下にある[レイヤ管理]ダイアログボックスを開きます。次に、意味レイヤの内容のリストに背景を含むデータを転送します。 </li><li>平均生データに対する平均背景データの位置を合わせます。そのためには、乗算や背景の末尾には、生データの最後尾と重複するまで、必要に応じてバックグラウンドデータを分割するために数学のメニューの下に簡単な数学関数を使用します。 注：このテール終了時に、目的のタンパク質からの寿命はすでに完全に離れて減衰しているはずです。何整列していることは、単にプロテアーゼ切断前と後の両方に存在するバックグラウンドシグナルである。 </li><li>もう一度簡単な数学関数を使用して、初期の生のLRET信号から整列背景信号を引きます。 </li><li> （サイトや実験計画に応じて、単一または複数の指数）指数関数的減衰にデータを合わせる。 <ol><li>終了後に開始するように装着するための開始境界を設定するレーザパルスの。後続のすべてのカーブフィッティングのためにこの同じ始点を使用してください。 </li><li>セレクトフィット関数]ダイアログボックスで、単一の指数関数的減衰のため、以下の式に寿命が適合するように指数関数的な減衰を選択します。 <img alt="式4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" />式4 ここで、yは蛍光強度を表し、yは0によるシステムからのノイズバックグラウンド強度を表し、1は信号強度であり、tは蛍光寿命であり、xは時間であり、x 0時間がオフセットされる。 </li><li>で、x 0から0修正フィット関数を起動し、データに合わせて。 注：実験のみサイトの一つ対からの信号を有するように設計されている場合、結果のデータは容易に単一指数関数的減衰8によって適合すべきである。フィットの残差は適合度を決定するための優れた方法であり、追加の減衰寿命はrequirある場合エド。 </li></ol></li><li>フェルスターの式（式1および上記2の再配置）を使用して、蛍光団との間の距離を計算するためにデータから得られた寿命を使用します。 <img alt="式5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" />式5 注：DAは 、感作アクセプター発光寿命として測定されたτして前述したように、すべての変数である。 R 0及びRの測定に関するさらなる詳細および実施例は、他の場所7,9,10-見出すことができる。 </li><li>再現性を確実にするために、少なくとも三回の実験及びデータ分析を繰り返す。同じ測定の個別の反復の間に矛盾が問題とデータの有効性を呼び出す。追加の制御実験や繰り返しを使用しています。エラーを伝播（博士トーマス·フーバーによって開発された）自由グスターヴォエラー解析計算または同様のシステムを使用して測定誤差を計算する一生に一度のフィット。 </li></ol>

<ol>
	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

LRETは、科学者が単一のタンパク質内だけでなく、多量体タンパク質中のサブユニットの間のドメイン間の距離を測定することができる強力な手法です。このように、LRETは、タンパク質または他の巨大分子の立体構造変化とダイナミクスを調べることに適しています。上記のプロトコルは、簡単に自分の仮説をテストするために、適切に装備ラボを許可する必要があります。しかし、新しい?...

発光共鳴エネルギー移動（LRET）は、周知の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術1の誘導体である。 FRETと同様に、LRETは10〜100オングストローム〜3の範囲内で、目的のタンパク質上の特定の部位に結合したドナーとアクセプターフルオロフォア間の距離と距離の変化を測定するために使用することができる。 LRETの原理は、その共鳴エネルギー移動にFRE​​Tに類似しているドナーフルオロフォアの発光スペクトルがアクセプターフルオロフォアの吸収スペクトルと重なった場合2近位の蛍光団の間で起こる。この移動の効率は、次式による二フルオロフォア間の距離に関係する。 <img alt="式（1）" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" />式1 R二つのフルオロフォア間の距離であり、Eは、専用の効率である以下に説明ギー転送、およびR 0は 、転送の効率が最大半減する距離、すなわち 、フルオロフォアペアのフェルスター半径である。この式から、人はその効率は逆6乗1に上げ、距離の大きさに関係して見ることができます。これは、FRETとLRET測定があっても、FRET対のR 0に近い小さな距離の変化に絶妙に敏感であることが可能になり、この逆6乗依存性である。具体的にはタンパク質または他の巨大分子上の所望の部位を標識する能力は、一方が立体構造変化を監視するには、この感度を活用することができる。 従来の有機色素分子を使用して、FRET、と比較すると、LRETは追加の利点を提供しています。 LRETでは、代わりにドナーフルオロフォア、ランタニド系列の陽イオン、典 ​​型的には、Tbの3+かのEu 3 +などの有機色素を使用するのではなく、1,4-6使用されている。 uの秋フルオロフォアそれらはアクセプターフルオロフォアの広い範囲で使用できるように、このカテゴリ、 例えば 、テルビウムキレートファインダーも非常に汎用性があります。キレート化ランタニドの発光スペクトルがアクセプターフルオロフォアの多種多様のいずれかで使用されるドナーフルオロフォアの単一種を可能にする、複数の鋭い発光ピークが含まれているので、この柔軟性が可能となる。このように、増感アクセプター発光はドナー発光5からのブリードスルーを汚染を恐れることなく検出することができる。実験者は、2つのフルオロフォア（ 図1および表1）との間の予想される距離に基づいて、特定の受容体を選択する。これらのキレート化ランタニド蛍光団で、金属イオンが高分子1上の特定の官能基にイオンを係留するために生物反応性官能基と同様に励起するために、通常、難吸収性のランタニドを感作アンテナグループを含む分子によってキレート化され、 5,6。 ONC電子励起し、ランタニドは、ミリ秒の範囲の減衰率を持つ光子の放出を介して基底状態に緩和する。減衰は一重対一重緩和も三重項対一重緩和でもないので、光子の放出を適切に蛍光または燐光を呼び出すことはできませんが、より適切にルミネ1と呼ばれる。ランタニド発光の長い減衰が大幅に寿命測定に役立ちます。寿命測定は、以下の関係を介して効率を決定するために使用することができる。 <img alt="式2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" />式2 ここで、Eは、伝達の効率であり、τDは、エネルギー移動に関与していないドナー（キレート化ランタニド）の寿命であり、アクセプターとのエネルギー伝達に関与するときτDAは、ドナーの寿命である。 LRET付き、τDAがアル缶テルビウムの寿命はそんなに大きな有機アクセプターフルオロフォアよりもあるので、そのように感作されたアクセプター発光の寿命として測定する。アクセプターは、その扇動励起（ドナーランタニド）と同じ寿命で発光し、アクセプタ自身の固有の蛍光寿命から寿命への寄与は相対的に無視できる。アクセプター、ドナーの1の比率：むしろドナー発光よりも感作された放射を測定することにより、私たちも正確に1にラベル付けを確保する必要がなくなります。タンパク質の代わりに受容体および供与体フルオロフォアの両方で同時に標識することができる。不均一に標識人口はなりますが、二重ドナー標識タンパク質は、アクセプター波長で発光せず、二重受容体標識されたタンパク質は、励起されることはありません。さらに、フルオロフォアの間の距離は同じであるべきであるにかかわらず、どのシステイン部位の特定のフルオロフォアはドナーとしての等方性ランタニドを使用する場合は特に、に付着するので、旧姓ドナーまたはアクセプタのいずれかを受信するために特定のサイトを指定するには、dは不要です。強度が不均一な集団で影響を受ける可能性があるが、依然として検出されるのに十分すぎるほどであるべきである。 実験を計画する際には、フルオロフォアの選択は、一組のR 0の値だけでなく、測定中の予想される距離範囲によって決定されるべきである。 R 0値は、次式で定義される。 <img alt="式3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" />式3 ここで、R 0はオングストロームでフェルスター半径、2κは（通常は3分の2であると仮定）は、2つの色素間の配向因子であり、φDは 、ドナーの量子収量であり、Jはドナーの間の積分スペクトルの重なりがある1 - Mにおける発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトル-1〜4nm ​​であり、nは媒質1の屈折率である。 当研究室では、プローブさ、タンパク質上のドナーとアクセプターラベル部位の間にプロテアーゼ認識部位を導入することにより、従来のLRET手法への変更を追加しました。この変更は、全哺乳類の細胞7などの非精製されたシステムでの調査が可能になります。標識化のための部位としてシステインを使用する場合に、システインのスルフヒドリル基に結合したマレイミド共役色素で標識する過程で、システインを有する細胞上の他のタンパク質も標識されているので、この技術は、特に有用である。しかし、目的のタンパク質に対するプロテアーゼ切断部位を含む、および切断前後の寿命を測定することにより、実験者は、定量的に生の信号からプロテアーゼ切断後のバックグラウンドシグナルを差し引くことができる。この減算は、（ 図興味のあるタンパク質から生じる特定の信号を分離するURE 2）。上記の変法を用いて、LRETは、タンパク質上のテルビウムキレートドナーおよびアクセプタープローブとの間の距離の変化を測定するため、精製を必要とせずに、タンパク質の近くの生理学的状態の立体配座の変化を監視するために使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> 赤図1。吸収と発光スペクトル黒でキレート化テルビウムのと同様に、代表的なアクセプター、アレクサ488、。複数の発光ピークとテルビウムキレートの各ピークシャープ、狭い発光範囲を注目してください。このパターンは、テルビウムアクセプターフルオロフォアの多様で使用することが可能となり、テルビウムには発光を示していないこれらの範囲内で感作された放射の測定を容易にする。 Aで非常によく重なって波長486におけるテルビウムの発光ピーク<html> 2のフルオロフォアの間で発生する共鳴エネルギー移動を可能にするアレクサ488のbsorptionピーク、。 515の波長は、テルビウムの発光ピークの間の谷にあり、非常に520ナノメートルのアレクサ488の発光ピークの近くに、このペアに対して感作された放射を検出するための優れた選択肢です。アクセプターピーク付近であることが望ましいものの、必要とされていない-565 nmは、まだまたテルビウム発光を検出することなく、アレクサ488放射を検出することが可能であることに注意してください。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> アクセプターフルオロフォア </td><td style="width:45px;"> R 0（Å） </td><td style="width:183px;"> 発光波長（nm） </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;">アトー465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;">フルオレセイン</td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;">アレクサ488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;">アレクサ680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;">アレクサ594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;">アレクサ555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><tr高さ= &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;">のCy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> 表1 LRETドナー11としてテルビウムキレートを使用するための一般的に使用されるアクセプターフルオロフォアのリスト 。ドナーおよびアクセプターは、AMPA受容体の可溶性アゴニスト結合ドメインに結合させた場合には、R 0値を測定した。それは、それぞれの新しいシステムが研究されて、再びR 0の値を測定することが理想的である。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> 図2に示さLRET方法の概要。（A）AMPA受容体は、リガンド結合時にコンフォメーション変化を受ける膜タンパク質である。クラムシェル形のリガンド - ビndingドメインはここに赤で丸で囲まれている。 （B）タンパク質に結合していない、AMPAのリガンド結合ドメインは、オープン構造（左）に存在します。グルタミン酸をリガンドに結合すると、タンパク質は、そのリガンド（右）を中心に閉じます。 LBD上の証拠のサイトでフルオロフォアを確定すると、このコンフォメーション変化の性質は、その後、蛍光寿命に影響を与えるフルオロフォアの変化との間の距離として見ることができます。 （C）全細胞を標識する場合、目的のタンパク質と同様に、バックグラウンドの膜タンパク質の両方の標識（左）起こり得る。プロテアーゼ切断した後、目的のタンパク質からLRET信号はそのままバックグラウンド信号（右）を残し、原因可溶性フラグメントが放出されなくなります。このバックグラウンド信号は、原信号から減算することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

発光共鳴エネルギー移動、またはLRETは、10〜100オングストロームの距離範囲内のタンパク質内の2つのサイト間の距離を測定するために使用される強力な技術である。さまざまなライゲーション条件下での距離を測定することにより、タンパク質のコンホメーション変化を容易に評価することができる。 LRET、ランタニド、最も頻繁にキレート化テルビウムにより、そのような長いドナーのみの発光寿命は、複数のアクセプターフルオロフォアを使用するには、柔軟性、および簡単な方法として、感作されたアクセプター発光を検出するための機会としての利点を与える、ドナー蛍光体として使用されているまた、ドナーのみの信号を検出するリスクなしに、エネルギー移動を測定した。ここでは、インタクトな哺乳動物細胞の表面上で発現され、アッセイされた膜タンパク質にLRETを使用する方法を記載する。私たちは、LRET蛍光団ペア間のプロテアーゼ切断部位を導入する。元のLRET信号を取得した後、その部位での切断は、タンパク質の特定のLRET信号を除去私たちは、定量的に切断した後に残る背景信号を減算することを可能に関心。この方法は、タンパク質の精製を必要とせずに行うべき複数の生理学的に関連性の測定を可能にする。

ランタニドドナーで成功LRET測定がミリ秒の時間範囲内にドナーだけの寿命を持っている必要があります。ドナーとアクセプターの両方で標識されたタンパク質の感作LRET発光の寿命は、バックグラウンド減算後の図3マイクロ秒の範囲の寿命を有する、特に短くなる。経時的に安定になるはず寿命の増加を切断結果をプロテアーゼ（ すなわち、もはやプロテアーゼ切断が完?...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

ここでは私たちはドナーとアクセプターフルオロフォアサイト間のプロテアーゼ切断部位を導入する改良された発光共鳴エネルギー移動（LRET）方法を記載している。この修​​飾は、タンパク質精製せずに膜タンパク質の研究を可能にする、目的の膜タンパク質から生じる特定のLRET信号を得ることを可能にする。

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K ビュー.  University of Texas Health Science Center at Houston. ここでは私たちはドナーとアクセプターフルオロフォアサイト間のプロテアーゼ切断部位を導入する改良された発光共鳴エネルギー移動（LRET）方法を記載している。この修​​飾は、タンパク質精製せずに膜タンパク質の研究を可能にする、目的の膜タンパク質から生じる特定のLRET信号を得ることを可能にする。 

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

ネガティブステインEMによるタンパク質と高分子複合体の可視化：グリッドの準備から画像取り込みに

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

生物工学

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

胎児肺細胞におけるメカノトランスを研究するための実験システム

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツール<em&gt;インビボ</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

哺乳類細胞培養を均一な骨材を生産する O の形をした船で揺れ、軌道

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

蛍光顕微鏡によるせん断流下の単分子の立体構造変化の特徴

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...