著者は、畜産のための「Animalerieサントラルドゥジフ=シュル=イヴェット」による支援を承認したいと思います。この作品は、欧州連合（EU）FP6助成」Embryomics」によってANR助成金」により、マイケル·シューベルトのANR（ANR-09-BLAN-0262から02とANR-11-JSV2-002-01）からの資金によってサポートされていましたANR-ジャン=フランソワ·ニコラとナディーンPeyriérasに10-BLAN-121801のDev-プロセス」。ジョアン·エマニュエルカルバリョは、FCTの博士フェローシップ（SFRH / BD / 2012分の86878）によって賄われている。 ここに記載されたベクターのリクエストは、著者に直接対処することができる。

機器·試薬の調製<ol style="margin-left: 40px;"><li>転送パスツールピペット<ol><li>異なる速度で炎の上に230ミリメートル長いパスツールピペットを引いて、異なる先端径の転送パスツールピペットのシリーズを生成します。テーパーは、吸引の円滑かつ微調整のために、できるだけ長くであることを確認してください。 </li><li>ダイヤモンドスクライブでは、ピペットの長さに垂直な線に沿ってピペットを傷つける。両手で、ブラントカットを生成するために、その長さにピペット平行に引く。迅速に難ポリッシュ先端を密封することなく、ピペット。 </li><li>ピペットでする卵母細胞/胚の段階で先端の直径が異なります（直径150μmの周りに）未受精卵のために300〜400ミクロン、受精卵（直径500ミクロン程度）のために600ミクロン、200〜400ミクロンハッチングneurulaeため。 1皿から卵母細胞/胚を転送するための口に監視吸引管で使用するピペット別。 </li></ol></li><li>注射針<ol><li> RNaseフリーの条件を確実にするために手袋で毛細血管を操作する。 OD 1.20ミリメートル、ID 0.94ミリメートル、長さ10ミリメートルの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。 </li><li>毛細血管が物質一覧に記載の加熱フィラメント針プラーの種類に引っ張られた場合は、次の設定を使用します：熱600は、ある形状を、確実に、それ以外の場合は50、速度80、時間60、圧力200または300を引いて成功した注射用の重要な、以下の特性を図2に示すように、4-8ミクロンの外側先端の直径、2cmのテーパー長を。 注：針は産卵期の前に引き出され、シーズンを通して使用することができます。 </li></ol></li><li> 5％フェノールレッド原液（4X） <ol><li>各産卵期の前に新鮮な準備をします。 </li><li> 0.22μmの濾過チューブでは、フェノールレッド粉末25mgを秤量。 </li><li> DNase-とRNaseフリー水0.5mlを追加粉末を含有するチューブ。 </li><li>溶液を濾過滅菌し、注射針を詰まらせる可能性の結晶を除去し、室温で18000×gで3-5分間スピン。 </li><li> 4℃で保存または-20℃で250μlのアリコートを保存する。 </li></ol></li><li> 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューション<ol><li>各産卵期の前に新鮮な準備をします。 </li><li>蒸留水20ml中のポリ-L-リジン5mgを溶解する。店舗-20℃で5ミリリットルのアリコート。 </li><li>ポリ - リジンコートディッシュに卵母細胞の再現可能と強固な密着性を確保するために、すぐに一度だけ解凍アリコートを使用してください。 </li></ol></li><li> mRNA合成<ol><li>各産卵期の前に新鮮な準備をします。 </li><li> （37℃で、通常は2時間、）適切な酵素で目的のDNA5μgのを線形化。消化の完全性をチェックするには、20分間150 WでTBE緩衝液中の1％アガロース - TBEゲル上で消化ミックスの容量で2％を実行します。 </li><li> LINEAを抽出24：1フェノール（pHは8.0）：クロロホルム：イソアミルアルコール25と、有DNA。 20秒、遠心18000×gで10分間、そして水（上）相を集めるための渦。 </li><li> 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。 </li><li> 10：300線状化DNA：3 M酢酸ナトリウム（pH5.2）：-20℃で一晩、100％エタノール100と線状化DNAを沈殿させる。 </li><li> 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 70％エタノールですすぎます。 </li><li> 4℃で18000×gで遠心し、10分。 RNaseフリー水ドライで再懸濁0.5μgの/μlの最終濃度でみましょう。 </li><li>製造業者の説明書に従って、適切なポリメラーゼによるmRNA合成キットを用いて線状化DNAを1μgを転写する。 </li><li> 1フェノール（pHは4.7）：5でmRNAを抽出しキットで提供さクロロホルム及び酢酸アンモニウム停止液。 </li><li> 20秒間ボルテックス、CEntrifuge 18000×gで10分間、水相を収集します。 </li><li> 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。 </li><li> -20℃で一晩、100％イソプロパノールでmRNAを沈殿させる。 </li><li> 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 80％エタノールですすぎます。 </li><li> 4℃で18000×gで遠心し、10分。それはその後再懸濁することは困難であるように、もはやより5〜10分間室温でペレットを乾燥してみましょう。少なくともを2μg/μlの最終濃度にDNase- RNaseフリー水に再懸濁し、注入混合物中のまともな最終のmRNA濃度を確保する。 </li><li>転写産物の品質とサイズを確認するには、20分間150 WでのTBE緩衝液中のRNaseフリーの1％アガロース - TBEゲル上のmRNAの0.5μLを実行します。ストア-80℃で2μlを。 </li></ol></li><li>ポリリシン被覆ディッシュ 注：ポリ - リジンCOAテッド皿を注入中に卵母細胞を固定化するために使用される。 <ol><li>各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、解凍した0.25 mg / mlのポリL-リジン溶液1mlをペトリ皿の底を覆う。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li>各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、別の35ミリメートル細胞培養シャーレに0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを転送する。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを捨てる。 </li><li> 2時間室温でペトリ皿を乾燥、逆さまましょう。 </li><li> 1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でプラスチックラップに包まれたポリ - リジンでコーティングされた料理を保管してください。 </li></ol></li><li>アガロース被覆ディッシュ 注：彼らは文化注入した胚に使用されている。アガロースを注入した胚のためのクッションを提供し、皿の底に付着するからそれらを防ぐことができます。 <ol><li>人工海水（ASW）37〜38グラム/ LのCOMMを使用してください逆浸透水でercial塩+ 0.25mMのNaHCO 3で 。 </li><li>電子レンジで溶液を加熱することにより、0.22μmの濾過されたASWアガロース1％の濃度に溶解させる。 </li><li>迅速皿の非常に薄いアガロースコーティングを確実にするために、別の1つに35ミリメートルのペトリ皿からの温かいアガロース溶液を注ぐ。 </li><li>サランラップに包まれたアガロースでコーティングされた料理は1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でラップ保管してください。 </li></ol></li><li>注射針の注入ミックスとロード<ol><li>注射を開始する前に約2時間、mRNAの1から1.8μgの/μlの最終濃度のRNaseおよびDNaseフリー水で2μL注入ミックスを作る、15％グリセロール、1.25％フェノールレッド。 注：フェノールレッドの色注入効率と成功して注入された胚の識別の監視を可能にするソリューション、。グリセロールは卵母細胞内のmRNAの拡散に有利に働く。 </li><li> 18,000×gで遠心分離し4分ペレットの結晶。使用するまで氷上に保管してください。 </li><li> 10μlのピペットを用いて、結晶がペレット化されたチューブの底を避け、注入ミックス0.5μlのを集める。 </li><li>針の大開口の噴射ミックス0.5μlの低下をピペッティングして（注入中の場合で1休憩）は、少なくとも2つの注射針のバックフィル。 </li><li>注射ミックスの蒸発を防ぐために4℃で底部に液体と保存瓶に針を取り付ける。注入混合物はゆっくりと気泡の発生を最小限にするために、少なくとも1時間、注射針の先端に移動してみましょう。 </li><li> mRNAの品質が劣化した後、3つの追加の用途は最大-80℃で保存追加噴射ミックス（データは示さず）。 </li></ol></li></ol> 2.生物材料、マイクロインジェクションの収集と胚培養<ol style="margin-left: 40px;"><li>卵母細胞と精子コレクション 注：·セオドショーを参照してくださいら産卵を誘導するため、および配偶子の収集のための詳細なプロトコール12。 <ol><li> 24時間23℃でASWで衝撃オスとメス。 </li><li>ほとんどの大人は日没後1〜2時間を起動しますので、日没前に1〜2時間は、19℃でASW内の個々のカップに大人を転送する。 </li><li>フィルタリングASWに35ミリメートルペトリ皿をすすぎ、それらに皿の底に付着するの卵母細胞を防止するために、ドライ逆さまにしましょう​​。 </li><li>産卵時には、すぐに千μlのピペットを用いて精子と卵母細胞を収集する。 <ol><li>精子を維持し、接点が配偶子の健康に有害であるため、卵母細胞は、成体ナメクジウオから分離した（データは示さず）。 </li><li>更に、精子及び卵母細胞の両方を消散動きにつながる、成人驚くべき避けるため、希釈する。可能な限り、アクティブな精子を維持すると、受精率の最適化をできるだけ濃縮精子を収集する。 </li></ol></li><li>キープ1.5ミリリットルチューブ内の氷の上で精子。 </li><li>前すすぎ、35ミリメートルペトリ皿に濾過ASWに卵母細胞を転送します。 </li><li>転送前に注射を実行するための別の35ミリメートルのペトリ皿に300〜400μmの転送パスツールピペットを引っ張った。と100〜500卵母細胞</li><li>精子と卵母細胞の質のために、または他の実験のための対照としてのクラッチの残りを肥やす。 </li></ol></li><li>卵母細胞注入<ol><li>水平面に対して50°の角度でマイクロマニピュレーターに注射針を取り付けます。 注：以上の50度の角度は卵母細胞に比べて針位置の適切な監視を許可しませんしながら、50°未満の角度は、皿の上の周りの卵母細胞をプッシュします。 </li><li> 25X接眼レンズを有する蛍光解剖スコープの下では、フィルタリングさASWを含むポリリジンコートディッシュに300〜400μmの転送パスツールピペットを用いて30卵母細胞を移す。 </li><li>運ぶためにラインに沿って卵母細胞を付着させる注文した方法で、注射外と非注入した卵母細胞から注入区別するために。発生中の胚を変形する傾向があるポリ - リジン、卵母細胞の曝露時間を最小限にするために少数（30卵母細胞）を注入した（データは示さず）。 </li><li>可能な限り半透明の卵母細胞をレンダリングする暗視野照明を使用してください。 </li><li>マイクロマニピュレータの粗動ノブで、卵母細胞に近い注射針をもたらす。 </li><li>細かい鉗子で、先端が湾曲し始めるレベルで針を切り開く。インジェクターでパルスすることにより、赤注入ミックスは、実際に針から流出していることを確認。 </li><li> 200Xの倍率でとマイクロマニピュレータの微動ノブで、優しく卵母細胞の核内部に注射針を動かす。 注：あまりにも表面的に挿入した場合、注入されたソリューションは、卵母細胞内部に残ることはありません。あまりにも遠く挿入した場合、卵母細胞が破壊されます。 </li><li> 120ミリ秒duratの1-3パルスで注入イオンと1-10 PSI圧力。針が十分に微細であれば、一定の圧力で連続流で注入する。注入量は、単一の卵母細胞の容積の1/3に1/5に対応していることを確認してください。 </li><li>注入後、卵母細胞の漏れを回避するために迅速に針を抜く。 </li><li>注入されたソリューションは、卵母細胞内で、数秒後に、注入されたソリューションは、卵母細胞全体に広がることに変わりはないことを確認します。 </li><li>行の次の卵母細胞へと移動します。 </li><li>注入した胚のためにスキャンするときにバックグラウンド蛍光を推定するために、陰性対照として各シリーズのいくつかの非注入胚を保管してください。 </li></ol></li><li>注入した胚及び胚培養の受精、選択<ol><li>とすぐに一連の注入されたように卵母細胞を受精。卵母細胞の品質が時間とともに低下したように、12を産卵した後1時間以内に卵母細胞を注入して受精さ。 </li><li>精子濃度に応じて、卵母細胞への精子の1-5滴を追加し、料理を旋回。 注：受精エンベロープは、約1分後の胚で明らかになる必要があります。 </li><li>卵母細胞の別の一連を注入しながら、胚はポリリジンでコーティングされた皿から切り離しできるようにする。 </li><li>アガロースでコーティングされたペトリ皿に600μmの転送パスツールピペットで胚を転送します。可能な限り2細胞期の前にあれば、できるだけ早くポリ - リジンコートディッシュから胚を削除します。 NOTE：ポリリジンへの長期曝露の場合、胚は皿の底に触れる側に平坦化稠密胞胚、​​になる傾向がある。 </li><li> 4細胞期に、2セルでは、DSRフィルター付き蛍光解剖スコープで正常に注入胚、 すなわち、フェノールレッド由来の赤色蛍光シグナルを示す正常な形態を有するものを選択する。 </li><li>所望の段階のためになるまで19℃でアガロースでコーティングされたペトリ皿中で濾過ASW中で培養中の胚を保つin vivoイメージングで。 </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この記事では、Bの注入のために、初めて、詳細かつ再現可能なプロトコルを提示lanceolatum卵母細胞、その、後にB. floridae 13,14及びB. belcheri 15は 、このようにしてそのような技術が記載されている第3ナメクジウオ種である。重要なことに、ここで説明するプロトコルは、Bの蛍光タンパク質の生産に適したベクター系の記述を含むインビトロ?...

開発中は、単一の細胞は細胞分裂や動きの両方が関与非常に複雑なプロセスで、生物全体を生じさせる。優れた細胞の挙動の力学の基礎となる生物学的原理を理解するために、発生生物学者は、蛍光ベースのインビボイメージング技術を使用し始めている。特定のこのような細胞膜などの細胞の区画のいずれかの蛍光色素での処理により標識することができる、特異性および組織浸透1の欠如によって妨げられアプローチ、または蛍光タンパク質2をコードする外因性mRNAの胚に特異的な導入による。別の技術は、mRNAのような外因性化合物の効率的な送達のために用いることができる。これらには、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子、リポフェクションおよび形質導入3,4との衝撃が、これらに限定されない。これらのアプローチの全ては、外来性化合物を導入するために使用することができるが胚を開発し、唯一のマイクロインジェクションは、各セル3内にあらかじめ定義されたと正確な量の適用を可能にする。マイクロインジェクション技術は、すべての主要な発達のモデル系4（ 例えば 、ショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ、カエル、マウス）のためだけでなく、発達のメカニズムの進化を理解することを目的とした比較研究のために使用されるものを含むいくつかの代替モデル4、のために記載されている（ 例えば 、イソギンチャク、環形動物ワーム、ウニ、ホヤホヤ、ナメクジウオのナメクジウオ）。 一緒にホヤと脊椎動物で脊索動物門を確立Cephalochordatesは、特に、脊索動物の進化と無脊椎動物の祖先5-8から脊椎動物の多様化を研究するために非常に適したモデルです。ナメクジウオ系統は、脊索動物の進化の過程で非常に初期の発散。 3属（ ブランに細分され、現存cephalochordates、chiostoma、AsymmetronとEpigonichthys）、全体的な解剖学とゲノムアーキテクチャ5-8の両面脊椎動物に似ている。これまでに記載されているcephalochordatesの約30種のうち、5人は発生学的と発達研究の6,9のために用意されていますAsymmetronのlucayanum（バハマのナメクジウオ）、Branchiostoma floridae（フロリダナメクジウオ）、Branchiostomaのlanceolatum（欧州ナメクジウオ）、 Branchiostoma belcheri（中国語ナメクジウオ）とBranchiostoma吸虫 （日本ナメクジウオ）。これらの種の3（B.のlanceolatum、B. belcheriおよびB. japonicumの ）の熟した大人の繁殖期10,11の間にオンデマンド産卵するように誘導することができる。さらに、少なくともBのlanceolatum、効率的な産卵も、それによって研究所のために、この特定のナメクジウオ種がアクセスできるように、人工海水12に誘導することができる自然海水へのアクセス権を持っていないIES。 Bの組み合わせ、 lanceolatum、そのようなマイクロインジェクションなどの効率的な配信方法で胚に便利で信頼性の高いアクセスのため、これまでに13〜15、（B。floridaeおよびB. belcheriの両方で）ナメクジウオで開発された唯一の送達技術は、の開発を可能にします系統tracing-と動的な細胞の挙動に基づくアプローチを含む整体技術の新規スイート。 B.蛍光タンパク質を発現するmRNAの効率的なマイクロインジェクションのためのプロトコルlanceolatum胚 、したがって開発されました。さらに、Bのライブイメージングのための基本的なツールキットを提供するためにlanceolatum胚 、ベクター系は、膜結合および蛍光タンパク質の核発現を可能にするように開発された。膜標的化するための、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）はmCherryをとeGFPの人間HRAS CAAXボックスと核局在化したこと融合させたゼブラフィッシュヒストン2B（H2B）エクソン（ 図1、補足ファイル1）への融合によって得られる。また、Bのタンパク質翻訳を最適化することを目標に、構築物のコザック配列及びコドンは改変されていると使用に適応lanceolatum。まとめると、ここで提示注入法および発現ベクターは、特に、最新の蛍光ベースの生体内イメージング技術を用いて分析し、cephalochordatesための新たな実験的アプローチを生成するための基礎として役立つ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

上記の詳細なプロトコールは、Bのマイクロインジェクションのための基礎を提供するlanceolatum卵母細胞、したがって、Bの開発に導入するためin vivoイメージングのための蛍光タンパク質をコードするmRNAのlanceolatum胚 。技術は、確かに堅牢で信頼性があるが、このプロトコルを使用して成功した注射の速度は可変（ 表1）のままである。この魅力的...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。

蛍光タンパク質の発現において<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt;未受精卵へのmRNA注入による

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

expression-fluorescent-proteins-branchiostoma-lanceolatum-mrna

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K ビュー.  Institut Pasteur. 私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

発生生物学

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

未熟ネコの最小体積ガラス化

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...