我々は、蛍光タンパク質をコードするプラスミドDNAを提供するためのマイクW.ダビッドソン（フロリダ州立大学）を感謝。この作品は、厚生助成金GM72048（DWPへ）の国立研究所によってサポートされていました。

1。蛍光タンパク質の液滴の試料の調製蛍光タンパク質の液滴のサンプルでは、​​水相内に存在する蛍光タンパク質と1 - オクタノールのエマルジョンで構成されています。このエマルジョンは、顕微鏡のアプリケーションのための顕微鏡スライド、22 mm角のカバーガラスの間に挟まれている。 <ol><li>蛍光タンパク質の液滴のサンプルを作る前に、顕微鏡スライドとカバーガラスは、疎水化剤で洗浄し、コーティングする必要があります。 </li><li>アセトンで5分間洗浄することによりガラスを清掃し、空気が乾燥しておきます。 （オプションで、ガラス製品を洗浄した後、最適なコーティングの結果を得るために、プラズマクリーナーで30秒間処理することができる）。 </li><li>この溶液中で2分間のインキュベーション中に、アセトンとコートガラス製品では2％メチル溶液を調製します。コー​​ティング後、溶液からガラスを取り除き、空気が乾燥しておきます。その後、スプレーボトルから70％エタノールで洗浄し、再び乾燥させておきます。 （オプションで、この時点でガラスは° Cの共有結合ガラスにコーティングをリンクするために80℃1時間焼成することができます）。コー​​ティングされたガラス製品は、少なくとも一ヶ月間保存することができます。 </li><li>蛍光タンパク質は、E.から彼の6 -タグ融合タンパク質として精製されていますコリ 1。精製されたタンパク質の吸光度スペクトルを測定し、STEバッファー（150mMのNaCl、10mMトリス- HCl pH8の、1mMのEDTA）で〜0.1の光学密度と株式の希薄化を準備、0.1％ウシ血清アルブミンを含む（BSA） 。加えて15 mlコニカルチューブ中の1 - オクタノールとSTEバッファーの1:1混合物の10mlを準備し、積極的に混ぜる。相分離が完了するまで、休暇を混合した後。上部相は、1 - オクタノールです。 （注意：1 - オクタノールは、強い香りを持っているので、それは1 - オクタノールと接触するすべてのもののために密閉廃棄物の容器を使用することが重要です。） </li><li>エマルジョンピペット45μlの1 - オクタノールとマイクロチューブに5μlの蛍光タンパク質を作るまで。エマルジョンの形成を開始してから、超音波浴中で30秒間チューブを超音波処理するために、指でチューブを数回タップします。で一方、コーティングされた顕微鏡スライドとカバーガラスの準備をする。超音波処理した後にエマルジョンは完全に曇りにする必要があります。すぐにコーティングされた顕微鏡スライド上に管の途中から超音波ピペット4μlのエマルジョンの後、コーティングされたカバーガラスで覆う。 </li><li>手続きが行われている場合、正しくエマルジョンは、顕微鏡のスライドとオブジェクトのガラスの間に均等に分散する必要があります。分以内にサンプルの直径を変えて〜10μmの厚さの蛍光滴から成る、安定している必要があります。最大の液滴は、試料の中心に近く、小さい方は、エッジに向かってさらに配置されています。 </li></ol> 2。光電変換実験のセットアップ次の手順では、蛍光タンパク質の光電変換テストを設定するための一般的な戦略です。この手順は、生きている細胞のためだけでなく、タンパク質の精製に適用することができます。 <ol><li>以下のパラメータは、光変換の実験を設定する一般的な出発点を提供します。 40倍1.3NA油浸対物レンズ 画像サイズ= 512 × 512ピクセル スキャンズーム= 4 ピクセルは、時間= 6マイクロ秒に住む。 Z -解像度（ピンホールのサイズ）= 3μmの</li><li>初期とphotoconverted蛍光だけでなく、&quot;光電変換チャネル&quot;の2つの検出チャンネルを設定します。この例ではオレンジ色から赤色photoconvertible蛍光タンパク質であるmOrange2タンパク質を、精製された使用します。オレンジ色の種は、561 nmの励起を用いて検出されると蛍光を570 nmと630nmの間に収集されます。 photoconverted赤い種は、633nmの励起を用いて検出されると蛍光が640 nmと700 nmの間に収集されます。 &quot;光電変換チャネル&quot;のために488 nmの励起を選択し、490nmのと540nmの間に蛍光を収集する。 （注：イメージング光電変換チャネルは、必ずしも必要ではありません。） </li><li>イメージングレーザパワーと、最適な画像品質のための検出器のゲインを調整するために連続スキャンと初期の蛍光のチャネルを使用してください。 </li><li>光電変換チャネルをアクティブにし、低レーザパワーを選択。撮影時間の経過のシリーズを起動し、初期の蛍光の漂白著しいが観察されるまで徐々に光電変換レーザーを増加させる。初期の蛍光が約75％漂白になるまでスキャンを続行。 </li><li>光電変換チャネルを停止し、photoconverted蛍光の検出チャンネルをアクティブにします。高い検出器のゲインと低レーザパワーとイメージングを起動し、photoconverted蛍光が検出されるまで徐々にレーザーパワーを増加させる。一度あなたがレーザーのパワーと、最適な画像品質のための検出器のゲインを調整することができますphotoconverted蛍光を検出する。 </li><li>最後に、レーザパワーは、使用光変換だけでなく、光変換の持続のために最適化する必要があります。光電変換レーザパワーを増加させると、光変換の速度を加速する、しかしあまりにも多くのレーザパワーは、タンパク質を退色されます。 </li><li>一度、最適な光変換レーザーのパワーと持続時間が決定されている、これらのパラメータは標準の光退色やFRAPモジュールを構成するために使用することができ、&quot;光電変換チャネルは、&quot;不要になります。 </li></ol> 3。 mOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライトために赤方偏移したスペクトル特性から、mOrange2は、4個のセル（オルガネラ）の集団を選択的に強調表示を可能にするデュアルプローブ光学ハイライトのための緑のphotoswitchable蛍光タンパク質Dronpa（ドロンパ）と組み合わせて使用​​することができます。 <ol><li>細胞をガラス底マテック皿に成長し、標準Lipofectamine2000トランスフェクション1を使用して撮影する前に24時間トランスフェクトされる。 </li><li>としてセクション2で説明mOrange2光変換用の顕微鏡を設定します。 </li><li>ドロンパのphotoswitching用顕微鏡を設定します。ドロンパの蛍光がmOrange2&quot;光電変換チャネルを&quot;（ステップ2.2参照）を使用して画像化することができます。 （注意：あまりにも多くのレーザーパワーがドロンパの不活化の原因となりますので、画像ドロンパのために使用されるレーザーパワーを最小化。）ドロンパの光活性化のためのチャネルを追加します。我々は、光活性化のために800nm​​の二光子励起を使用しますが、代わりにこれを405nmの励起を用いて達成することができます。イメージング、光活性化、そしてドロンパ蛍光の光不活性化するために必要なレーザーパワーを決定します。 </li><li>注意：mOrange2の光変換とドロンパの不活性化は、両方とも488 nmの励起によって起こる。このためにも、ドロンパの蛍光を不活性化するmOrange2光変換に必要な高いレーザーパワーの。一方、ドロンパの不活性化は非常に低いレーザーパワーで既に発生し、大幅なmOrange2光変換することなく行うことができます。 </li><li> mOrange2光変換し、ドロンパのphotoswitchingのパラメータを設定したら、デュアルプローブ光学ハイライトは以下の手順によって実現されます。最初に、低消費電力488 nmの励起で視野全体でドロンパの蛍光を不活性化する。第二に、ハイパワー488 nmの励起との利益とphotoconvert mOrange2の領域を選択します。最後に、ドロンパの蛍光をアクティブにするために関心領域を選択します。 </li></ol> 4。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。液滴試料調製を。）正しく滴のサンプルを用意した。 B）サンプルはコーティング顕微鏡スライドとカバーガラスなしで準備。 C）サンプルは、0.1％BSAを添加することなく準備。 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 mOrange2タンパク質を含むmOrange2光変換で光電変換レーザーのパワーと持続時間の影響。単一液滴が連続して488 nmのレーザパワーの異なる量を使用してphotoconvertedていた。光変換のために使用される相対的なレーザーパワーが10％（固形）、25％（破線）、および100％（点線）であった。 A）オレンジ蛍光種。 B）Photoconverted赤色蛍光種。 <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 mOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライト。ミトコンドリアの核と緑色蛍光のオレンジ色の蛍光を示す光変換前mOrange2 -ヒストンH2Bとドロンパ-水戸の発現）細胞、。 B）ドロンパの蛍光がmOrange2の最小限の光変換を引き起こし、低消費電力488 nmの励起をオフにした。 C）mOrange2は、高出力488nmの励起で赤色にphotoconvertedした。 D）ドロンパの蛍光は再び800nm​​の2光子励起を使用してオンにした。パネルは、微分干渉コントラスト画像と一緒に蛍光画像のオーバーレイです。

<ol>
	<li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins.">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

精製した蛍光タンパク質の液滴のサンプルでは、​​光退色反応速度論と光電変換反応速度を研究するために、例えば、蛍光タンパク質の光物理的特性評価のための非常に便利なサンプルフォーマットです。非常に小さな液滴の体積（〜20ピコリットル）のキュベットベースのシステムで実行することが困難な場合も退色や光変換の実験を、容易に。ここに示されているように加えて、液滴?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Microsope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>48312-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22 mm cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>2940-245</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-octanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>O4500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>methyltrimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MatTek dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-019</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells

Photoconvertible蛍光タンパク質は、（PC - FPS）蛍光の色が特定の波長の光への曝露によって変更することができることを意味する、&quot;光学式ハイライト&quot;機能を持つ蛍光タンパク質のクラスです。光の強調表示は、非侵襲的蛍光分子の集団をマークすることを許可されているので、単一の細胞または細胞小器官を追跡するのに最適です。 効率的な光変換のための重要なパラメータは、光電変換光の強度と露光時間です。強度が低すぎる場合、光変換は全く発生が遅いかどうかになります。一方、多すぎる強度や長すぎる露出は、タンパク質の光退色し、それによって光変換の効率を減らすことができます。 このプロトコルは、どのようにPC - FPの光電変換アプリケーションのための共焦点レーザー走査型顕微鏡を設定する一般的なアプローチを説明します。まず、精製されたタンパク質の液滴の試料を調製するための手順を説明します。このサンプルフォーマットには、顕微鏡下で蛍光タンパク質の光物理的挙動を研究するために非常に便利です。第二に、我々は、光変換用の顕微鏡を構成する方法を示すために蛋白質の液滴のサンプルを使用します。そして最後に、我々はmOrange2とドロンパとのデュアルプローブ光学ハイライトを含む生きている細胞の光学強調表示、実行する方法を説明します。

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Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

このプロトコルは、共焦点レーザー走査型顕微鏡に蛍光タンパク質の光変換を実行するための一般的なアプローチを説明します。我々はpuriedタンパク質試料の光変換用だけでなく、mOrange2とドロンパと、生細胞におけるデュアルプローブ光学ハイライトするための手順を説明します。

生細胞で蛍光タンパク質とのデュアルプローブ光の強調表示を精製の光変換

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

12.1K ビュー.  Vanderbilt University. このプロトコルは、共焦点レーザー走査型顕微鏡に蛍光タンパク質の光変換を実行するための一般的なアプローチを説明します。我々はpuriedタンパク質試料の光変換用だけでなく、mOrange2とドロンパと、生細胞におけるデュアルプローブ光学ハイライトするための手順を説明します。

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

生物学

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...