これらのプロトコルは、溶媒ベースの沈殿によりタンパク質の回収率と純度を最大化するように設計されています。バイアルで沈殿を実行するためのいくつかのトリックと、スピンカートリッジ形式での半自動アプローチを紹介します。また、沈殿プロトコルを最適化して、一貫性と迅速性を実現しました。
プロトコル全体は数分しかかかりません。これらのプロトコルは、タンパク質の溶媒沈殿が質量分析に先立つサンプル調製に理想的であることを示しています。プロトコルは、ボトムアップおよびトップダウンのプロワークフローにシームレスに適合します。
今日私たちのためにデモンストレーションするのは、ノバスコシア州ハリファックスのプロテオフォームサイエンティフィックのシニアサイエンティストであるZiheng DangとVictoria Millerです。 ピペット 90マイクロリットルの粒子状遊離タンパク質溶液をポリプロピレンマイクロ遠心チューブに入れます。次に、10マイクロリットルの1モル塩化ナトリウム水溶液と400マイクロリットルのアセトンをサンプル溶液に加え、キャップをしてバイアルを軽くたたき、溶媒を混ぜ合わせます。バイアルがそれをインキュベートするのを待ちます。
インキュベーション後最低2分間室温で乱されず、バイアルの向きに注意してサンプルを遠心分離し、室温で10, 000 RCF以上で最低2分間スピンします。遠心分離後、チューブの底部に目に見える白いペレットが観察されます。この時点で、チューブのキャップを外し、チューブを反転させて上層を廃棄物容器にデカントします。
ペーパータオルを使用して、バイアルから残留溶媒を引き出します。サンプルを含むSDSの場合。ペレットを乱すことなく、400マイクロリットルの新鮮なアセトンを慎重に分注します。
バイアルを最初のスピンと同じ向きでローターに入れることにより、室温で10, 000倍G以上で1分間サンプルを直ちに遠心分離します。前述のように洗浄溶剤を数えます。キャップを開けた状態でサンプルを約1分間乾燥させます。
ドラフト内で、ペレット可溶化の前。100マイクロリットルのタンパク質溶液をポリプロピレンバイアルに分注します。ドラフトに、400マイクロリットルのメタノールを追加し、続いて100マイクロリットルのクロロホルムを追加します。
バイアルとボルテックスを短時間キャップして混合します。300マイクロリットルの水をバイアルの中央に直接すばやく分注します。バイアルにキャップをし、ポリプロピレンバイアルを遠心分離機に入れ、室温で10, 000倍G以上で5分間回転させた後、1分間邪魔されずにベンチトップに座らせます。
バイアルは、2つの溶媒層および約45度でバイアルまで目に見える白いペレットを有することが観察される。バイアル内にビーズが形成されるまで、最初に1ミリリットルの大きなマイクロピペットチップを使用して、後で200マイクロリットルのピペットチップを使用して、上層から約700マイクロリットルの溶媒を均一な速度で除去します。バイアルの側面に溶媒を分注することにより、ペレットを乱すことなく400マイクロリットルの新鮮なメタノールをサンプルバイアルに追加します。
バイアルにキャップをし、バイアルを静かに揺らして溶媒を一緒に渦巻かせて溶媒層を結合します。室温で10, 000倍G以上で最低10分間ローター遠心分離機でバイアルの配向に注目して白色タンパク質ペレットを観察する。ペレットを下に向けてバイアルを傾けます。
バイアルの上端に沿ってピペットチップを置き、1ミリリットルのマイクロピペットチップで上清をゆっくりと均一な速度で除去します。約20マイクロリットルの溶剤を保持します。残留溶剤をヒュームフード内で乾燥させます。
タンパク質を沈殿させる。使い捨てのろ過カートリッジを使用して、プラグを上部のろ過カートリッジに取り付けます。90マイクロリットルのタンパク質溶液10マイクロリットルの1モルアクア、塩化ナトリウム、400マイクロリットルのアセトンを混ぜ合わせます。
ベンチトップで最低2分間インキュベートし、室温 G.At 2, 500倍で2分間ろ過カートリッジに取り付けられたプラグで調製したタンパク質サンプルを遠心分離し、カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外します。ろ過カートリッジを清潔なバイアル遠心分離機に入れ、タンパク質サンプルを室温で500倍Gで3分間行います。下部バイアルから溶媒の流れを捨てます。
ろ過カートリッジに400マイクロリットルのアセトンを加えてタンパク質ペレットを洗浄し、室温で500倍Gで3分間遠心分離するか、上部カートリッジに溶媒がなくなるまで遠心分離します。以前に実証されたタンパク質沈殿プロトコルに従います。タンパク質ペレットの再可溶化のための再可溶化プロトコルに進む直前に、2〜5マイクロリットルのISOプロパノールを膜に直接分注することにより、ろ過カートリッジの基部で膜を濡らしてタンパク質を再可溶化し、水中のギ酸の80体積体積溶液を調製する。
この酸性溶液を摂氏マイナス20度で事前に冷却し、沈殿したタンパク質を含むろ過カートリッジを冷却します。50マイクロリットルの冷希釈ギ酸を冷やしたカートリッジキャップとボルテックスに30秒間分注します。ろ過カートリッジを摂氏マイナス20度で10分間冷凍庫に戻します。
前の渦とインキュベーションのステップを繰り返します。最終容量500マイクロリットルに450マイクロリットルの水を加えます。ギ酸を8%に希釈カートリッジを裏返し、ネジを外してカートリッジベースからプラグを取り外し、SPEカートリッジをバイアルに取り付けます。
室温の遠心分離機でSPEカートリッジを通してタンパク質を800倍Gで5分間回転させます。 上部カートリッジに溶媒が残っている場合は、カートリッジを遠心分離機に戻し、スピンを繰り返します。300マイクロリットルの5%アセトニトリルと0.1%のTFAを水中でSPEカートリッジに加えてすすぎ、SPEカートリッジを2000倍Gで2分間流し、低分子量タンパク質または消化ペプチドを300マイクロリットル流してサンプルを溶出します。50%アセトニトリルと0.1%のTFAを2、500倍のG.Forで5分間インタクトタンパク質。
300マイクロリットルの75%アセトニトリルと0.1%トリフルオロ禁欲酸を使用した追加の溶出ステップでフォローアップします。得られた2つの抽出物を結合します。この図は、使い捨てフィルターカートリッジ内のバイアルベースまたはタンパク質の沈殿後のSDS枯渇を比較しています。
従来の迅速およびCMWプロトコルでアセトンを使用する。すべてのアプローチは、最適な質量分析を可能にするためにSDSを低減します。この図は、処理された酵母全細胞溶解物のSDSページ分析による急速なアセトン沈殿およびCMW沈殿による定量的タンパク質回収を示しています。
すべての沈殿プロトコルで一貫した回収率が得られました。使い捨てろ過カートリッジでの沈殿により、メンブレンフィルターの上に凝集タンパク質を保持しながら、上清を含むSDSを注意深くピペットでピペットで固定する必要がなくなります。したがって、3つの独立した反復にわたる上清画分に目に見えるバンドは検出されませんでした。
カートリッジベースのタンパク質沈殿は、バイアルベースの沈殿と比較して、ウシ血漿のペプシン消化サンプルの優れた回収率を示します。塩化ナトリウムを使用し、亜鉛溶媒を使用した場合、カートリッジには収率のより有意な違いが認められ、最高の収率が得られました。この図は、使い捨てフィルターカートリッジで処理されたサンプルのより高いペプチド存在量を反映する1を超える比率で、各ペプチドサンプルからのペプチドピーク強度を定量化します。
この図は、3つの反復サンプル調製物間でタンパク質あたりの同定されたペプチドの数を比較しています。これらのグラフの0.94〜0.95の相関係数は、ボトムアップ質量分析のためのサンプル調製アプローチの高い一貫性を示しています。したがって、そのペレットが形成されたら、それを邪魔することを避けたいのです。
無傷のペレットとして保管すると、歩留まりが向上します。したがって、そのペレットを余分なアセトンで洗うことを忘れないでください。これにより、サンプルを可能な限りクリーンに保つSDSを取り除き、最高の質量分析が可能になります。
そのため、サンプルをピペットで固定するよりも、反転させて余分な溶媒を除去する方がはるかに簡単であることがわかりました。このようにして、より一貫した歩留まりが得られます。室温でアセトン沈殿を行うと、冷凍庫での従来の沈殿よりも一貫性があり、迅速な回収が得られました。
