Bu yöntem etkili Drosophila melanogaster bir viral enfeksiyon kurmak hakkında virüs-host etkileşim alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu nanoenjeksiyon yöntemi ve virüsün enfeksiyon dozu hassas bir kontrol sağlar kolayca diğer mikrobiyal patojenler ile enfeksiyonlara uygulanabilir. Bir saat boyunca 25 santigrat derecede ek karbondioksit olmadan tam Schneider's Drosophila Orta 10 mililitre ile gevşek, yarı yapışık monolayer olarak mililitre başına yedinci canlı S2 yıldız hücreleri bir kez 10 büyüyerek başlayın.
Kuluçka sırasında, taze çözülmüş Drosophila C Virüs veya DCV tam orta bir mililitre 0.01 enfeksiyon çokluğu için resuspend ve hücre kültürü yemekleri virüs çözeltisi ekleyin. Sonra plakayı 25 santigrat derece kuvöze 3-5 gün iade edin. Hücre morfolojisi bulanık göründüğünde ve kültür ortamı hücre enkazını gösteren siyah parçacıklarla dolu olduğunda virüs toplanmaya hazırdır.
Eksi 80 santigrat derece de konak hücrelerin insis için 15 mililitrelik bir tüp için tüm hücre kültürü aktarmadan önce birkaç kez pipetting tarafından supernatant karıştırın. Virüs çalışma konsantrasyonları oluşturmak için, santrifüj ile hücre enkaz peletleme önce sürekli sallayarak 25 derece santigrat su banyosunda hücre süspansiyon çözültün. Daha sonra yeni bir steril 15 mililitrelik tüp içine girdap ve aliquot kadar 200 mikrolitre virüs çözeltisi tüp başına aktarın.
Ortalama virüs doku kültürü enfektif dozu belirlemek için, ilk tohum bir kez 10 beş S2 yıldız hücrelerine tam orta 100 mikrolitre içinde sekiz kuyu lar sütun başına 12 satır 96 kuyu plaka. Sonra plakayı 25 santigrat derece kuluçka makinesine geri ver. Eksi 80 santigrat depolamadan rastgele beş virüs tüpü seçin.
Hücreler yerleşirken, 10 steril 1,5 mililitrelik mikrosentrifüge tüpleri 450 mikrolitre steril komple orta ile doldurun ve ilk 1,5 mililitrelik tüp içeren 50 mikrolitre virüs stoku ekleyin 450 mikrolitre steril komple orta süspansiyonlar 12 kuyuya adım başına 10 kat seyreltme. Kuluçka sonunda, virüs bu tüp için her sütunda uygun kuyuya her seyreltme 50 mikrolitre ekleyin ve negatif kontrol iyi olarak sütun başına bir iyi virüs olmadan kültür ortamı 50 mikrolitre ekleyin. Sonra üç gün boyunca 25 santigrat derece kuvöz plaka yerleştirin ve 20X büyütme günlük bir Brightfield mikroskop altında her virüs stokunun sitopatik etkisini değerlendirmek.
Hücrelerin bulanık göründüğü ve ortamın parçalarla dolu olduğu bir kuyuyu pozitif kuyu ve hücre morfolojisinin negatif kuyu olarak normal olduğu bir kuyu olarak sınıflandırın. Üremeden önce, tetrasiklin mililitre başına 50 mikrogram 400 mikrolitre taze standart mısır unu sinek gıda dört gram karıştırın ve etanol buharlaştırmak için bir gecede dört derece santigrat gıda yerleştirin. Ertesi sabah, oda sıcaklığına gıda sıcak ve 20 kadın ve 10 erkek yeni kapalı yetişkin 25 derece santigrat ve normal bir ışık / karanlık döngüsü altında% 60 nem üç ila dört günlük üreme kuluçka için bir üreme şişe içine sinekler gıda yerleştirin.
Yeterli yumurta yumurtladığında, karbondioksit Hafif bir akış altında yeni ekaplanmış yetişkin sinekler toplamak ve tekrar iki kez daha sadece gösterildiği gibi Drosophila doğurmak. Tetrasiklin arıtma üç nesil sonra, karbondioksit bir ışık akışı altında beş sinek toplamak ve çift distile su 250 mikrolitre ve birkaç 0,5 milimetre steril seramik boncuk ile sinekhomojeize. Bir dakika sonra, eksi 80 santigrat derece numune dondurma önce girdap için örnek 250 mikrolitre 2X Tampon A ekleyin.
Daha sonra, eksi 80 santigrat derecelik bir su banyosundaki numuneleri hızla eritin, ardından genomik DNA'yı çıkarmadan ve standart protokollere göre polimeraz zincir reaksiyonu ile DNA'yı yükselterek 70 derecelik bir su banyosunda 30 dakikalık bir kuluçka. Wolbachia 16 küçük RNA ve wsp her sinek jel elektroforez standart protokollere göre homojen yokluğu doğrulayın. Sonra standart mısır unu sinek gıda wolbachia ücretsiz sinek stok arka gösterildiği gibi.
Viral enfeksiyon için, ilk nanoenjeksiyon için uygun çapa bir cam kılcal iğne ucu kırmak için bir stereomikroskop ve ince forseps kullanın. Enjektörü monte etmek için tavan o-halkasını ve beyaz bir boşluk, enjektörün metal pistonuna yerleştirin ve dışa bakan büyük gamzeyi yerleştirin. Mineral yağ ile cam iğne doldurmak ve yaka ile iğne yerleştirmek için 30 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga kullanın.
İğnenin künt ucundan yaklaşık bir milimetre yaka tabanıetrafında büyük O-halkayerleştirin ve enjektör un piston üzerine iğne monte. İğneyi pistonun üzerine sabitleyin ve mikroenjektörün pistini sesli bir sinyal duyulana kadar uzatmak için boş düğmeye basın. Şimdi pistonu beş milimetre geri çekmek ve iğneyi 100 plak oluşturan birim viral süspansiyona batırmak için dolguya basın.
Yavaşça enjeksiyon çanak üzerine 20 Wolbachia içermeyen erkek Drosophila bir veya en az üç şişe sallayın. Çiftleme sırasında erkek uçaklar tercih edilir ve üreme dişileri etkileyebilir. Daha sonra mezopleura ve pteropleura arasında biraz daha hafif renkli bölgede virüs çözeltisi 50,6 nanolitre ile her sinek toraks enjekte ve sitopatik etki testi ve kantitatif RT PCR tarafından DCV yükünü ölçmek sadece gösterildiği gibi yer uçar.
Enjeksiyondan sonra, sinekleri dikkatlice taze bir şişeye aktarın ve anesteziden kurtulurken sineklerin ortama yapışmasını önlemek için şişeyi yatay bir konuma yerleştirin. Enjeksiyon zaman alıcı ama DCV çoğaltma çok hızlı bu yüzden her şişe sinekler tüm enjekte edilmiş kez tüp üzerinde tam zaman yazmak önemlidir. Virüs enfeksiyonu hücre liksise neden olabilir ve sitopatik etkiler enfeksiyon dan sonra üç gün gözlenir.
Wolbachia 16s rRNA ve wsp astarlar wolbachia ve Drosophila varlığını tespit etmek için kullanılabilir gösterildiği gibi. Wolbachia-free sinekler DCV enfeksiyonu sonrası ve doza bağımlı bir şekilde önemli ölçüde azalmış sağkalım oranı sergiler. DCV, Dicer-2 mutant sineklerinde azalmış sağkalım oranı ve artan viral yük ile kanıtlandıkça Drosophila'da antiviral enfeksiyon için kritik öneme sahip konaktaki antiviral sinyal yollarını aktive eder.
Bu prosedürü çalışırken, Wolbachia genotip ile kontaminasyon Drosophila melanogaster DCV enfeksiyonu uçar duyarlılığı etkileyebilir hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, viral enfeksiyon veya antiviral yanıtlar için gerekli tanımlanmış konak genleri altında hakkında ek sorulara cevap vermek için daha büyük ölçekli genetik ekran gibi diğer yöntemler yapılabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, drosophila melanogaster modelinde endemik insan viral enfeksiyonların salgınlarının altında yatan mekanizmaları araştırmak için insan viral hastalık alanında araştırmacılar için yol açtı.
Virüsle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu ekipmanın takılması gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
