Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de interação entre vírus e hospedeiros sobre como estabelecer efetivamente uma infecção viral em Drosophila melanogaster. Este método de nanoinjeção permite um controle preciso da dose de infecção do vírus e pode ser facilmente aplicado a infecções com outros patógenos microbianos. Comece crescendo uma vez 10 a a sétima células estelares S2 viáveis por mililitro como monocamada solta e semi-aderente em um prato de cultura celular de 10 centímetros com 10 mililitros de Drosophila Medium completo schneider sem dióxido de carbono adicional a 25 graus Celsius por uma hora.
Durante a incubação, resuspenque o vírus Drosophila C ou DCV recém-descongelado para uma multiplicidade de infecção de 0,01 em um mililitro de meio completo e adicione solução de vírus aos pratos de cultura celular. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus por três a cinco dias. O vírus está pronto para coleta quando a morfologia celular parece embaçada e o meio de cultura está cheio de partículas negras indicativas de detritos celulares.
Misture o supernasce por pipetar algumas vezes antes de transferir toda a cultura celular para um tubo de 15 mililitros para lise das células hospedeiras a menos 80 graus Celsius. Para gerar concentrações de trabalho do vírus, descongele a suspensão celular em um banho de água de 25 graus Celsius com agitação constante antes de pelotas dos detritos celulares por centrifugação. Em seguida, transfira o supernascer para um novo tubo estéril de 15 mililitros para vórtice e alíquota de até 200 microliters de solução de vírus por tubo.
Para determinar a dose infecciosa média da cultura do tecido do vírus, primeira semente uma vez 10 para as cinco células estelares S2 em 100 microliters de meio completo em oito poços por coluna em 12 linhas de uma placa de 96 poços. Em seguida, devolva a placa para a incubadora Celsius de 25 graus. Selecione aleatoriamente cinco tubos de vírus a partir de menos 80 graus Celsius de armazenamento.
Enquanto as células estão se instalando, encha 10 tubos de microcentrífugo estéreis de 1,5 mililitros com 450 microliters de meio completo estéril e adicione 50 microliters de estoque de vírus ao primeiro tubo de 1,5 mililitro contendo 450 microliters de meio estéril completo diluindo as suspensões 10 vezes por passo ao 12º poço. Ao final da incubação, adicione 50 microlitadores de cada diluição ao poço apropriado em cada coluna para esse tubo de vírus e adicione 50 microliters de meio de cultura sem vírus a um poço por coluna, bem como o controle negativo. Em seguida, coloque a placa na incubadora 25 graus Celsius por três dias e avalie o efeito citopático de cada estoque de vírus sob um microscópio Brightfield em uma ampliação de 20X diariamente.
Classifique um poço em que as células pareçam embaçadas e o meio esteja cheio de fragmentos como um poço positivo e um poço no qual a morfologia celular é normal como um bem negativo. Antes da reprodução, misture completamente 400 microlitadores de 50 microgramas por mililitro de Tetraciclina com quatro gramas de alimentos frescos padrão de mosca de fubá e coloque o alimento a quatro graus Celsius durante a noite para evaporar o etanol. Na manhã seguinte, aqueça a comida à temperatura ambiente e coloque a comida e 20 fêmeas e 10 machos recém-eclosed adulto voam em um frasco de reprodução para uma incubação de reprodução de três a quatro dias a 25 graus Celsius e 60% de umidade sob um ciclo normal claro/escuro.
Quando ovos suficientes foram colocados, colete as moscas adultas recém-eclosadas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e crie o Drosophila novamente mais duas vezes como apenas demonstrado. Após três gerações de tratamento tetraciclina, colete cinco moscas sob um fluxo leve de dióxido de carbono e homogeneize as moscas com 250 microliters de água dupla destilada e algumas contas de cerâmica estéreis de 0,5 milímetros. Após um minuto, adicione 250 microliters de 2X Buffer A à amostra para vórtice antes de congelar as amostras a menos 80 graus Celsius.
Em seguida, descongele rapidamente amostras de menos 80 graus Celsius armazenados em um banho de água de 25 graus Celsius, seguido de uma incubação de 30 minutos em um banho de água de 70 graus Celsius antes de extrair o DNA genômico e amplificar o DNA pela reação em cadeia de polimerase de acordo com os protocolos padrão. Confirme a ausência de Wolbachia 16 pequeno RNA e wsp em cada mosca homogeneizado por eletroforese de gel de acordo com os protocolos padrão. Em seguida, criar o estoque de mosca livre de Wolbachia em alimentos padrão de mosca de fubá, como demonstrado.
Para infecção viral, primeiro use um estereómico e fórceps finos para quebrar a ponta de uma agulha capilar de vidro ao diâmetro apropriado para nanoinjeção. Para montar o injetor, coloque o teto o-ring e um espaçador branco sobre o êmbolo metálico do injetor com a covinha grande voltada para fora. Use uma seringa equipada com uma agulha calibre 30 para encher a agulha de vidro com óleo mineral e coloque a agulha através da coleira.
Coloque o anel O maior ao redor da base do colarinho cerca de um milímetro da extremidade cega da agulha e coloque a agulha no êmbolo do injetor. Fixar a agulha no êmbolo e pressionar o botão vazio para estender o êmbolo do microinjetor até que um sinal sonoro seja ouvido. Agora pressione o preenchimento para retrair o êmbolo de cinco milímetros e mergulhe a agulha em uma suspensão viral de 100 unidades formadoras de placas.
Agite suavemente um ou pelo menos três frascos de 20 Drosophila masculino sem Wolbachia no prato de injeção. Moscas dotadas machos são preferidas durante o acasalamento e a reprodução pode influenciar as fêmeas. Em seguida, injete o tórax de cada mosca com 50,6 nanolitros de solução de vírus na região colorida ligeiramente mais clara entre a mesopleura e a pteropleura e meça a carga de DCV por ensaio de efeito citopático e RT PCR quantitativo de moscas terrestres como apenas demonstrado.
Após a injeção, transfira cuidadosamente as moscas para um frasco fresco e coloque o frasco em uma posição horizontal para evitar que as moscas grudem no meio enquanto se recuperam da anestesia. A injeção é demorada, mas a replicação do DCV é muito rápida, por isso é muito importante anotar o tempo exato no tubo uma vez que todas as moscas de cada frasco tenham sido injetadas. A infecção por vírus pode induzir a lise celular e os efeitos citopáticos são observados em três dias após a infecção.
Os primers wolbachia 16s rRNA e wsp podem ser usados para detectar a presença de Wolbachia e Drosophila como demonstrado. As moscas livres de wolbachia apresentam uma taxa de sobrevivência significativamente reduzida após a infecção pelo DCV e de forma dependente de doses. O DCV ativa vias de sinalização antiviral no hospedeiro que são críticas para a infecção antiviral em Drosophila, como evidenciado pela diminuição da taxa de sobrevivência e aumento da carga viral em moscas mutantes Dicer-2.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a contaminação com o genótipo wolbachia pode afetar a suscetibilidade das moscas de Drosophila melanogaster para a infecção pelo DCV. Após este procedimento, outros métodos como uma tela genética de maior escala podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre genes de hospedeiro definidos necessários para infecção viral ou respostas antivirais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da doença viral humana explorarem os mecanismos subjacentes a surtos de infecções virais humanas endêmicas no modelo Drosophila melanogaster.
Não se esqueça que trabalhar com vírus pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar o equipamento de proteção apropriado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
