小胞体は、細胞骨格と連続的に相互作用する動的な管状ドメインを含み、一定の動きおよび再配置を受ける。ER がこの組織をどのように生成し、維持しているかはまだ完全には理解されていません。ここでは、複雑な脂質ナノチューブネットワークに転移できる固形タンパク質非含有膜系からなるERのボトムアップ構造オルガネラモデルを形成するのに便利な事項を提示する。
親水性はエネルギーのための有機化合物です。タンパク質精製およびタンパク質抽出は必要ありません。唯一の必須成分は、最も基本的なERモデルを提供する固体基質およびリン脂質である。
溶解した脂質溶液を10ミリリットルの逆梨形フラスコに移し、合計3,000マイクログラムの脂質と300マイクロリットルのクロロホルムを加えます。次にフラスコをロータリーエバポレーターに接続し、45度の傾きで位置づけします。水浴内で24 RPMのフラスコを摂氏23度で6時間回転させ、空気圧を下げ、クロロホルムをゆっくりと完全に取り除きます。
圧力が20キロパスカルに達するまで、2分ごとに20キロパスカルのステップで回転を開始した直後に圧力を下げ始めます。6時間後、回転を停止し、100キロパスカルに達するまで2分ごとに20キロパスカルのステップで再び空気圧を再び増加させます。回転式蒸発器からフラスコを取り出し、PBSの3ミリリットルとグリセロールの30マイクロリットルを追加します。
フラスコを軽く旋回させてグリセロールを溶解します。気密ガラスストッパーを使用して、脂質を含むフラスコを密封します。フラスコを冷蔵庫に一晩摂氏4度で保管し、脂質フィルムの水分補給と膨潤を行います。
翌日、室温で超音波水浴で脂質を超音波処理し、均一なわずかに濁った脂質懸濁液を達成するまで35キロヘルツ周波数で。超音波処理は約10〜30秒かかることがあります。長時間の超音波処理は熱を生成し、病的な形成に有害です。
これらのステップは、2種類の静脈構造を含む懸濁液を生み出す。マルチラメラ小胞と巨大な単層小胞。貯蔵のために、合計30マイクロ遠心分離管を使用して100マイクロリットルのアリコートに脂質懸濁液を分割する。
アリコートをマイナス20度の冷凍庫に保管してください。液体窒素でのフラッシュ凍結は必要ありません。脂質懸濁液を解凍し、4マイクロリットルの懸濁液をきれいなガラス顕微鏡スライドまたはカバースリップに移します。
20分間の乾燥の後、液滴は目に見える脂質の平らな円形フィルムに崩壊する。HEPESバッファーの1ミリリットルで脂質膜を3分間再水和する。テキストプロトコルで詳述されているようにER変換を開始するために必要とされる自動ピペットによってバッファ交換を可能にするために、オープントップで観測室を準備します。
ヘラで硬化したPDMSスラブを取り除いた後、メスを使用して、顕微鏡ステージで利用可能な開口部に適した寸法と形状にフレームを切断します。1.5 x 1.5 x 0.5センチメートルの寸法は、ほとんどのセットアップに適しています。PDMSフレームの滑らかな側面を、酸化アルミニウムフィルムが存在する表面のアクティブ側に接触させ、圧力を加えてフレームと表面を互いに押し合って接着させます。
すぐにカルシウムHEPESバッファーで観察室を充填します。その後のステップで水分補給脂質の添加を可能にするために、チャンバ全体の体積を満たしてはなりません。コンフォーカル顕微鏡のステージにチャンバーを置きます。
再水和した脂質材料(現在は巨大な小胞を含む懸濁液)をプラスチック製の牧草地ピペットを持つチャンバーに移します。小胞が基板に接着し、表面全体に広がるように10〜20分待ちます。広がりは、表面に脂質を堆積した直後に開始します。
脂質が広がる前に、緩衝液交換は、表面上の脂質構造を摂動する緩衝液の迅速な除去または迅速な添加を可能な限り穏やかに行わなければならない。複数の脂質の広がりを観察した後、自動ピペットを介して周囲バッファをゆっくりと除去する。薄い緩衝膜のみが底部に残る。
迅速な除去を避けるために注意してください。自動ピペットを使用して、観察室をキレートヘルペスバッファでゆっくりと充填することにより、アンビエントバッファ交換に進みます。突然の追加を避けてください。
最後のステップは、キレートがDLBMを多層小胞にデキシングおよび後退させた結果として形成された動的ナノチューブネットワークをもたらす。ここに示されているのは、プロトコルで得られたナノチューブネットワークの顕微鏡写真である。この画像では、連続した明るい赤い領域は、青色の破線でマークされたDLBMの引き込み分率です。
ここに示す、コントラストを高めるために反転された管状ネットワークの顕微鏡写真である。ここで、管状密度の低下は、3時間及び20分間にわたって膜領域上に示される。管状密度の減少は、徐々にデキニングが続き、表面からのDLBMの引き込みが続くため生じる。
カルシウム媒介ピンポイントの位置は、チューブが端子または鋭いターンを有するポイントとして確立することができる。鋭いターンは、チューブの位置合わせ方向の急激なシフトのために、v 接合点または回転点と呼ばれます。終点は管が引き込まれるのを防ぐ管の終点を表す。
広がりが長期間続くと、膜張力が増加し、破裂する。脂質は蛍光標識されているので、破裂は直接観察することができる。破裂の重要な指標は、破裂した領域における蛍光強度の有意な低下である。
サンプルの完全な脱水または緩衝液の急速な交換は、パッチの妨害、破裂、または変形を引き起こす。モデルの複雑さは、脂質タンパク質などのER関連成分を添加することによって構築することができます。そして、このモデルはまた、自己集合体、ナノ流体、マランゴンフロー、および輸送現象を研究するために暗示することができます。
クロロホルムは有毒で揮発性が高く、常にヒュームフードの下で、ポリ酢酸ビニルラボグローブ、ラボコート、安全メガネなどの関連する個人用保護具で扱う必要があります。
