著者らは、プラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNは11の彼の種類のギフト用プラスミドpQE9交流10 ATRP 12、博士トム·ミューア（プリンストン大学）の彼の種類のギフトのためのデビッドTirrell（カリフォルニア工科大学）を承認したいと思いますプラスミドの彼の種類のギフトpJD757 13用プラスミドたpET30-CutA-TIP1 10、博士ジェイD.キースリング（UCバークレー）の彼の種類のギフトのための博士武久松田（テクノロジー、白山、石川県の金沢工業大学） 。この作品は、全米科学財団キャリア、米国空軍YIPとノーマン·ハックマン先進研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

1。プラスミド構築注：すべての遺伝子は、製造業者の仕様に従ってのPhusion高忠実度DNAポリメラーゼを使用する標準的なPCR反応条件下で増幅した。クローニングに用いたプライマーは以前に記載されている9。全ての構築物を表1に示す。 <ol><li> CutA-NpuN（N、表1）を生成する。 <ol><li> PCRは、適切なプライマーを用いて、それぞれのプラスミドたpET30-CutA-TIP1 10とKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの11からCutAとNpuN遺伝子を増幅。 </li><li>適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびN（図2A）を生成するC-末端タグの間6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。 </li></ol></li><li> NpuC-S-CutA（C、表1）を生成する。 <ol><li> PCRはNpuC、CutAとSフラグメンテーションを増幅適切なプライマーを用いて、それぞれプラスミドKanR-IntRBS-NpuNC-CFNの11、たpET30-CutA-TIP1 10とpQE9交流10 ATRP 12からT [AG 3（PEG）] 10。 </li><li>適当な制限酵素でこれらの断片を消化し ​​、順次、T7プロモーターおよびC（図2B）を生成するC-末端との間の6xHistidineいるpET26Bベクターにこれらのフラグメントを挿入する。 </li></ol></li><li> ：NpuC-S-SH3 LIG-CutA（C-SH3のLIG、 表1）を生成する<ol><li> PCRは、フラグメントのSH3 LIG-CutAを生成するのSH3 LIG（PPPALPPKRRR）と柔軟なリンカー（GGGGS）2を含むプライマーを使用してCutAを増幅する。 </li><li>フラグメントSH3 LIG-CutAとCからCutA遺伝子を交換してください。 </li></ol></li><li> SH3-GFP（ 表1）を生成する。 <ol><li>使用してプラスミドpJD757 13からSH3遺伝子を増幅適切なプライマー。 </li><li> GFP遺伝子にこの断片を融合し、T7プロモーター（ 図2C）およびC末端6xHistidineタグとの間にいるpET26Bベクターに挿入します。 </li></ol></li></ol> 2。タンパク質の発現<ol><li>適当な発現プラスミドで化学的にコンピ大腸菌 BL21（DE3）の50μlのを変換します。 </li><li>形質転換後、連続的にこれらの細胞を希釈し、ルリア - ベルターニ（LB）上にプレート/ 50μg/ mlのカナマイシンを含む寒天プレート。 </li><li> 〜15時間、37℃で形質転換された細胞を含むプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの後、50〜100個のコロニーが含まれているプレートをピックアップし、LBブロス5mlに全てのコロニーを懸濁します。 </li><li>転送サスペンションカナマイシン（50μg/ mlの）を含む1LのLBブロスに、250rpmで振盪しながら37℃で細胞を増殖させる。 600ナノメートル（OD 600）での吸光度をモニターする。 OD 600〜0.8までの文化を育てる。 <ol><li> C及びC-SH3 LIGのために、培養（最終濃度1mM）にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を加えることでタンパク質発現を誘導し、250rpmで振盪しながら4時間37℃で培養物をインキュベートする。 </li><li> NおよびSH3-GFPについては、約5分間、氷水浴中で培養フラスコを浸漬することにより培養物を〜18℃に冷却する。文化（1mMの最終濃度）にIPTGを添加することにより、タンパク質の発現を誘導し、250rpmで振とうしながら14〜18時間、18℃で培養液を、。 </li></ol></li><li>タンパク質発現の後、ペレットを収集するために、4℃で20分間、6,000×gで培養物を遠心分離する。使用するまで-80℃で保存した細胞ペレット。 </li></ol> 3。タンパク質精製<ol><li> Nの精製（変性条件） <ol><li>湿ったペレットを10ミリリットル/ gで、緩衝液A（ 表2）に再懸濁細胞ペレット。 </li><li> Immers氷水浴中でペレット懸濁液を電子と（1秒パルスおよび1分6秒の休止とアンプ10、）超音波処理により細胞を破壊する。 </li><li> 4℃で20分間16,000×gで溶解液を遠心分離</li><li>上清を捨てる。バッファDA（8 M尿素を含有する）及び遠心分離機で4℃で20分間16,000 xgで懸濁液中にペレットを再懸濁</li><li>以前にバッファDAで平衡化した5ミリリットルのNi-ニトリロ三酢酸（NTA）カラムに通して上清を渡します。 </li><li> 45 mMイミダゾールを補ったバッファーDAの30ミリリットルでカラムを洗浄します。 150 mMイミダゾールを補充した緩衝液20mlのDAを使用して精製したタンパク質を溶出させる。 </li><li> 3.1.7.1または3.1.7.2で与えられ、次のいずれかの方法により、&lt;1 mmのタンパク質試料中の尿素濃度を低下させる。 <ol><li> &lt;20 kDaのカットオフを有するチューブを用いて4℃で一晩DPBS緩衝液（ 表2）でタンパク質を透析する。 </li><li>遠心分離器は、30＆＃中のタンパク質を精製した160; 2,800 xgでkDaの限外濾過スピンカラム、4°Cにまで体積1 ml未満である。タンパク質試料を希釈するために列に14ミリリットルのDPBSバッファーを追加します。遠心分離/希釈は3回以上繰り返し繰り返します。 </li></ol></li><li>バッファー交換した後、精製したタンパク質（最終2mM）をにジチオスレイトール（DTT）を追加し、2800×gで30kDaの限外ろ過スピンカラム、4℃を通して遠心分離により〜100 mg / mlのにタンパク質を濃縮</li><li>使用するまで-80℃で濃縮されたタンパク質や店舗を分取。 </li></ol></li><li> CおよびC-SH3 LIGの精製（ネイティブ条件） <ol><li> 10ミリリットル/湿ったペレットのgで1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した緩衝液Bに再懸濁細胞ペレット（pH6.0）である（ 表2）。標的タンパク質のタンパク質分解を最小にするために、酸性緩衝液を使用する。 </li><li> 3.1.2に記載のように超音波処理により細胞懸濁液を破壊する。遠心分離機のLys4℃で20分間16,000×gで食べたし、上清を保持します。 </li><li>以前にバッファーBで平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して可溶性溶解を渡す</li><li>緩衝液Bで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補充し、および150 mMイミダゾールを補充した緩衝液Bを20mlの標的タンパク質を溶出させる。 </li><li> Cの場合は、3.2.6に進みます。 C-SH3のLIGについては、3.2.5.3と3.2.5.1ステップで与えられている部分的に分解されたタンパク質を除去するために追加のイオン交換精製工程を行う<ol><li> 3.1.7で説明した手順に従って、&lt;1 mmのLIG C-SH3中のNaCl濃度を低下させる。 </li><li>予めリン酸ナトリウム緩衝液（50mM、pH7.0）で平衡化させた5mlの陰イオン交換ビーズアガロースマトリックスカラムに標的タンパク質をロードする。 </li><li>溶出液は、10mMトリス-HCl pH8.0のbuffeを含有する溶液の勾配を実行して、カラムからタンパク質を標的とする1 M NaClを補充した同じ緩衝液を含有する溶液にrであるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に基づいて、最高純度のタンパク質溶出プール試料中にサンプルを採取する。 </li></ol></li><li> 3.1.7に記載のように、DPBSバッファー中に精製されたタンパク質を緩衝液交換。 </li><li>精製されたタンパク質（最終濃度2 mM）をにDTTを追加し、3.1.8で説明したように〜100 mg / mlの30kDaの限外ろ過スピンカラムを使用してタンパク質を濃縮。分量とストアが使用するまで-80℃でタンパク質を濃縮した。 </li></ol></li><li> SH3-GFPの精製<ol><li> 10ミリリットル/湿ったペレットのgの緩衝液Aを使用して再懸濁細胞ペレット。 </li><li> 3.1.2で説明したように超音波処理によりペレットサスペンションを混乱させる。 </li><li>遠心4℃で20分間16,000 xgで溶解物および上清を回収する。 </li><li>以前で平衡化した5mlのNi-NTAカラムを通して上清（可溶性溶解）を渡す緩衝液A </li><li>緩衝液A 30mlで洗浄カラムは、45 mMイミダゾールを補った。緩衝液A 20mlの溶出を用いて精製したタンパク質を150 mMイミダゾールを補充した。 </li><li>緩衝液は、3.1.7で述べたものと同様のアプローチを用いてDPBS緩衝液中に精製されたタンパク質を交換し、〜150mgのタンパク質を濃縮/ mlの3.1.8に記載されるように30kDaの限外濾過スピンカラムを用いて。 </li><li>使用するまで-80℃で精製タンパク質をアリコートし、保存します。 </li></ol></li><li> CutAを含む精製サンプルのSDS-PAGE分析<ol><li> 〜1 mMのNaCl濃度を減少させるために二重蒸留水に各精製タンパク質を希釈する。このNaCl濃度で、CutA三量体タンパク質のほとんどは、SDS-PAGEゲル上で単量体として実行する。 </li><li> 95℃でインキュベートした2×SDSサンプル緩衝液（0.5 Mトリス - 塩酸、pH 6.8、20％グリセロール、10％/ vのSDS、0.1％w / vブロモフェノールブルー、2％β-メルカプトエタノールw）を有する試料を混合5分間。 </li><li> SAMを読み込む12％SDS-PAGEゲル上にples。 〜50分間、200Vの定電圧で電気泳動を行う。 </li><li>標準プロトコル（ 図1C）は、次のクマシーブリリアントブルーR250で染色することにより、ゲル中のタンパク質を観察します。 </li></ol></li></ol> 4。ヒドロゲル形成注：特に断りのない限り、本研究で作成したサンプルのヒドロゲルは、各ヒドロゲルビルディングブロックの1.6 mMのが含まれています。このタンパク質濃度は柔らかく、安定したヒドロゲルが得られる。注意：アジ化ナトリウム（NaN 3を ） は、細菌汚染を防ぐために、w / vの最終濃度0.5％にヒドロゲルに添加される。のNaN 3は、非常に毒性があり、化学物質等安全データシートに示されているように、細心の注意を払って取り扱わなければならない。 <ol><li> 100μlのサンプルヒドロゲル中に1.6 mMの最終濃度を達成するために必要な濃縮タンパク質のそれぞれについて体積を計算する。たとえば、次のように Nの濃度：100 mg / mlの Nの分子量：26.3 kDaの（ 表1を参照してください） 所望の体積：100μlの所望の濃度：1.6 mMの <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> 100μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C言語を混在させる（XμL、容量4.1に従って計算）5％のNaN 3（10μL）で、100のDTT（5μL）とN（YμL、音量に応じて算出4.1）2を10mlのガラスバイアルの内部。 </li><li>最終容量100μlを達成するために、バイアルに（Y）μL - - X（85）と、手動ピペットチップを使用して旋回運動を経由してすべてのコンポーネントを混在させるDPBSバッファーを追加します。注意：ソリューションは、混合時に非常に粘稠になる。 </li><li>気泡を除去するために8,000×gで2分間混合物を遠心分離する。 </li><li>室温で混合物をインキュベートインテイントランス -スプライシング反応が完了に到達させるために一晩温度。逆さにチューブを回して、ハイドロゲル形成を確認してください。ハイドロゲルが形成されるとタンパク質が流れない。 </li><li> 3.4（ 図1C）で説明したように、ステップ4.2の前にし、SDS-PAGEゲル上でステップ4.5の後に採取した試料（0.5μLずつ）チェックして、インテトランススプライシング収量を推定する。 </li></ol> 5。ドッキングタンパク質（DP）とドッキングステーションを経由して、GFPの固定化ペプチド（DSP）の相互作用<ol><li> 50μlのGFP-官能化ヒドロゲル（1.2 mm）を作るために1.7での1:1のモル比で、（4.1に従って計算、XμL）C-SH3のLIGを組み合わせて、SH3-GFP（YμL、4.1に従って計算） mlマイクロ遠心チューブ30分間室温で混合物をインキュベートする。 </li><li> X - - ​​&lt;5％のNaN 3（5μL）、100のDTT（2.5μL）、（42.5の追加同じチューブにEM&gt; Y）μlのDPBS。 N及びC-SH3 LIGの1:1モル比を達成するためにN（yの μlの4.1に従って計算）を添加する。旋回運動によりピペットチップを用いて試料を混合する。 </li><li> 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を暗所で室温で一晩混合物をインキュベートする。インキュベーション中にSH3-GFPフォームをカプセル化ヒドロゲル。 </li></ol> 6。有機溶媒中の酵素反応のための固定化の足場として1.6 mMのハイドロゲルの使用<ol><li>モデル酵素として、HRPを使用してください。 DPBS中のHRP（28 mg / mlのか、0.63ミリモル）のストック溶液を準備します。 </li><li> HRPを捕捉30μlのハイドロゲル（1.6 mm）を作るために、C内の HRP（2μL）、5％のNaN 3（3μL）およびDTT（100 mMと1.5μL）と（XμL、4.1に従って計算）を組み合わせ1.7ミリリットルの遠心管。 </li><li> N（Yを追加する&lt;/ em&gt;の4.1に従って計算μL、）とDPBS（23.5 - X - Y）μL。旋回運動をピペットチップで混ぜる。 </li><li> 2分間8,000×gで遠心分離し、混合物を室温で一晩インキュベートする。 注意：以下の活性アッセイに用いジェンツは非常に有毒である。対応する化学物質等安全データシートにより、特定の安全勧告を使用してください。 </li><li>酵素反応は、N、N-ジメチル-p-フェニレンジアミン（5.8 mM）を、n-ヘプタン14中のフェノール（5.8ミリモル）およびtert-ブチルヒドロペルオキシド（2.9ミリモル）を含有する反応カクテル1mlのヒドロゲルを沈める。手動ヒドロゲルおよび溶媒の接触面積を増加させるためにピペットチップを用いてゲルを破壊する。 </li><li>プレートリーダー（ 図5）で546 nmでの異なる時点で採取した試料の吸光度を測定することにより、HRP生成物、インドフェノール系色素を検出する。 </li> &lt;/ OL&gt;

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競合する経済的利益は存在しません。

本研究では、安定性の高いインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を示した。分割の使用は、条件付きインテインつの液相の成分の混合に対応して形成されるヒドロゲルを可能にする。具体的には、分割インテイン共有結合ターンでヒドロゲルに自己アセンブル単位を架橋することにより隣接されるポリペプチドユニットを得、 トランス -スプライシング反応を介して2つの液相の...

タンパク質の全く作らヒドロゲルは大幅に組織工学、薬物送達およびbiofabrication 1のように多様な分野を進める可能性を運ぶ。彼らは、生体適合性と非侵襲的に生体活性球状タンパク質の取り込みをサポートするための可能性を含め、従来の合成高分子ヒドロゲルを上回る利点を提供します。 本研究では、分割インテイン媒介タンパク質トランス-スプライシング反応およびタンパク質固定足場（ 図1）としてのその適用を介して形成された新規タンパク質、ヒドロゲルの開発を記載している。このヒドロゲルのためのビルディングブロックは、各々が（INおよびIC）を分割インテインおよび多量体タンパク質の架橋サブユニットのN-またはC-末端断片を含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。のDnaEはインテノストックパンクチ （NPU）から&lt;ホリコシパイロコッカスから2,3インテ分割し、小さなトリマータンパク質（12 kDa）のCutAとして使用された/全角&gt;は架橋タンパク質4,5として使用した。異なる架橋剤は高度に架橋されたタンパク質ネットワーク（ハイドロゲル）の形成を導く、インテイン触媒によるトランス - スプライシング反応を介して接合されている。 NPUのインテインは、その高速な反応速度（T 1/2 = 63秒）、高トランススプライシング利回り（近い80％） の2,3の選ばれた。 CutAタンパク質は、その高い安定性のために、架橋剤として選ばれた。 CutAトリマーは、近い150℃の変性温度を持っているし、できるだけ多くのM 5として塩酸グアニジン4,6を含む溶液中で三量体四次構造を保持する。異なる架橋剤間のサブユニット交換は、物理的なハイドロゲル表面侵食7の主要な原因であることから、CutA非常に強い間、サブユニットの相互作用は、より安定したヒドロゲルにつながるようなサブユニットの交換を阻止する必要があります。これらのビルディングブロックの一つは、水を容易にするために、中間ブロックとして親水性の高いS-ペプチド断片を含むリテンション8。 2ヒドロゲルのビルディングブロックの混合は、両末端に架橋剤と、より長いポリペプチド鎖を生成し、フラグメントインテインINとICの間のトランス-スプライシング反応を開始する。複数のそのような分子単位の架橋剤は、高度に架橋されたヒドロゲル網目構造（ 図1A）を形成し 、互いに相互作用する。特定の「ドッキングステーションペプチド」（DSP）「ドッキングタンパク質」（DP）の安定な固定化を容易にするために、ヒドロゲル構成要素の1つに組み込まれているタグ化標的タンパク質へのヒドロゲル。のみならず、ヒドロゲルアセンブリを媒介するインテイン分割の使用は、タンパク質、ヒドロゲル合成のための追加の柔軟性を提供するだけでなく、標的タンパク質前ヒドロゲル形成にロードされるように、全体ヒドロゲルを通して標的タンパク質の高密度で均一な充填を可能にする。 インテイン媒介タンパク質ハイドロゲルは非常に安定である室温で3ヶ月後のリトル·ツー·検出可能な浸食と、水溶液中のBLE。安定性のpH（6-10）および温度（4-50℃）の広い範囲内に保持し、ヒドロゲルはまた、有機溶媒と適合性である。緑色蛍光タンパク質（GFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）：このヒドロゲルは2つの球状タンパク質の固定化のために使用される。後者のタンパク質を捕捉するヒドロゲルを有機溶媒に生体触媒を実行するために使用される。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:541px;" width="541">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Name 
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Company
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Catalog Number
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Comments
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:23px;">
			Phusion High Fidelity DNA polymerase
			</td>
			<td style="width:111px;height:23px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:23px;">
			M0530S
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:23px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Competent Escherichia coli BL21 (DE3)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			New England BioLabs
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			C2527I
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Luria Bertani
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			90003-350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Bacto Agar Media
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=90000-760">90000-760</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			kanamycin sulfate
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			<a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=97061-602">97061-602</a>
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			IPTG
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5820
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Imidazole
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-5720
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Urea
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			EM-9510
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			BP172-5
			</td>
			<td style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Protease Inhibitor cocktail
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Roche Applied Science
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			11836153001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			DPBS
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			VWR
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			82020-066
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Brilliant Blue R
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			A0297990
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sodium Azide
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC190380050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Horseradish peroxidase
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			P8125-5KU
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			N,N-dimethyl-p-phenylene diamine
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC408460250
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			phenol
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC149340500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			tert-butyl hydroperoxide
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			AC180340050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			Caution, highly toxic
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			n-heptane
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Acros Organics
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			120340010
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;"></td>
			<td style="width:111px;height:21px;"></td>
			<td style="width:118px;height:21px;"></td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Shaker/Incubator
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Fisher Scientific
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Max Q 6000
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Centrifuge
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Sorvall
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			RC 6
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Sonicator
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			QSonica
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			Misonix 200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Ultrafiltration Tubes
			</td>
			<td style="width:111px;height:21px;">
			Amicon Ultra
			</td>
			<td style="width:118px;height:21px;">
			UFC903024
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			&#160;Ni Sepharose High Performance HisTrap column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5248-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td nowrap="nowrap" style="width:175px;height:21px;">
			HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			GE Healthcare Life Sciences
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			17-5156-01
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:175px;height:21px;">
			Plate reader
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:111px;height:21px;">
			Molecular Devices
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:118px;height:21px;">
			SpectraMax Gemini EM
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:137px;height:21px;">
			
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of an intein-mediated artificial protein hydrogel

当社は、分割インテイン触媒によるタンパク質トランススプライシング反応によって媒介性の高い安定なタンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質のブロックコポリマーである。親水性の高いランダムコイルは、保水性ブロックコポリマーの1つに挿入される。 2タンパク質のブロックコポリマーの混合は両端に架橋剤とペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガするヒドロゲルに急速に自己集合。このヒドロゲルは、酸性および塩基性の両方の条件下で、50°Cまでの温度で、有機溶媒中で非常に安定である。せん断誘発の破裂後のヒドロゲルは、急速な改革。ヒドロゲルビルディングブロックに「ドッキングステーションペプチド」の組み込みは、「ドッキングタンパク「タグ化標的タンパク質の簡便な取り込みを可能にする。ヒドロゲルは、組織培養増殖培地と互換性のある20 kDaの分子の拡散をサポートし、生​​物活性球状タンパク質の固定化を可能にする。有機溶媒適合性、生体触媒としてインテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの適用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素をカプセル化し、その活性を確証することによって実証された。

インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルを形成するための模式図を図1Aに提示される。ヒドロゲルのビルディングブロックは、タンパク質がCutA-NpuN（N）およびNpuC-S-CutA（C）（ 図1A、表1）コポリマーである。 NpuN / Cノストックパンクチ（NPU）からインテ自然に分割のDnaEのN-/C-fragmentsです。 CutAはパイロコッカスホリコシ 4,5から安定した三量体タンパク質で...

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Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントランススプライシング反応をトリガします。このヒドロゲルは、有機溶媒に対応して、高度なpHおよび温度安定性であり、簡単に機能的な球状タンパク質が組み込まれています。

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

synthesis-of-an-intein-mediated-artificial-protein-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.0K ビュー.  Texas A&M University, College Station. 当社は、分割インテイン媒介タンパク質ヒドロゲルの合成を提示する。このヒドロゲルのビルディングブロックは、それぞれが分割インテインの架橋剤及び半分となる三量体タンパク質のサブユニットを含む二つのタンパク質の共重合体である。二つのタンパク質の共重合体の混合は、ヒドロゲルに自己組織化ペプチドユニットを得インテイントラン?...

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

生物工学

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

An Additive Manufacturing Technique for the Facile and Rapid Fabrication of Hydrogel-based Micromachines with Magnetically Responsive Components

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels have simple monolithic architectures and often function as scaffolding materials for tissue engineering applications. More sophisticated structures typically take a long time to fabricate and do not contain moving components. This protocol describes a photolithography method that allows for facile and rapid microfabrication of PEG structures and devices. This strategy involves an in-house developed fabrication stage that allows for the rapid fabrication of 3D structures by building upwards in a layer-by-layer fashion. Independent moving components can also be aligned and assembled onto support structures to form integrated devices. These independent components are doped with superparamagnetic iron oxide nanoparticles that are sensitive to magnetic actuation. In this manner, the fabricated devices can be actuated using external magnets to yield movement of the components within. Hence, this technique allows for the fabrication of sophisticated MEMS-like devices (micromachines) that are composed entirely out of a biocompatible hydrogel, able to function without an onboard power source, and respond to a contact-less method of actuation. This manuscript describes the fabrication of both the fabrication set-up as well as the step-by-step method for the microfabrication of these hydrogels-based MEMS-like devices.

An additive manufacturing strategy for processing UV-crosslinkable hydrogels has been developed. This strategy allows for the layer-by-layer assembly of microfabricated hydrogel structures as well as the assembly of independent components, yielding integrated devices containing moving components that are responsive to magnetic actuation.

ハイドロゲルを用いたマイクロ磁気応答性の高いコンポーネントとの容易な迅速な製造のための製造技術の添加剤

Polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels are biocompatible hydrogels that have been approved for use in humans by the FDA. Typical PEG-based hydrogels ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3 D プリントされた多孔性セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル足場

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These issues represent drawbacks in workflows that can ultimately result in irreproducibility of research findings. Manual-based workflows are further limiting the advancement and widespread adoption of viscous materials, such as hydrogels used for biomedical applications. These challenges can be overcome by using automated workflows with standardized mixing processes to increase reproducibility. In this study, we present step-by-step instructions to use an open source protocol designer, to operate an open source workstation, and to identify reproducible mixtures. Specifically, the open source protocol designer guides the user through the experimental parameter selection and generates a ready-to-use protocol code to operate the workstation. This workstation is optimized for pipetting of viscous materials to enable automated and highly reliable handling by the integration of temperature docks for thermoresponsive materials, positive displacement pipettes for viscous materials, and an optional tip touch dock to remove excess material from the pipette tip. The validation and verification of mixtures are performed by a fast and inexpensive absorbance measurement of Orange G. This protocol presents results to obtain 80% (v/v) glycerol mixtures, a dilution series for gelatin methacryloyl (GelMA), and double network hydrogels of 5% (w/v) GelMA and 2% (w/v) alginate. A troubleshooting guide is included to support users with protocol adoption. The described workflow can be broadly applied to a number of viscous materials to generate user-defined concentrations in an automated fashion.

This protocol serves as a comprehensive tutorial for standardized and reproducible mixing of viscous materials with a novel open source automation technology. Detailed instructions are provided on the operation of a newly developed open source workstation, the usage of an open source protocol designer, and the validation and verification to identify reproducible mixtures.

ヒドロゲルベースの3D培養モデルを自動化および標準化された方法で製造するためのオープンソース技術プラットフォーム

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.