<p class="jove_content"&gt;我々は、洞察力のある議論のためにDD張を感謝し、寛大に試薬を提供する。 MJは、NIHの循環器研修グラント、アリゾナ技術​​研究イニシアティブ基金、および大学の科学者のための達成の報酬でサポートされています。この作品は、NIHのディレクターの新イノベーター賞（1DP2OD007161 - 01）、国立科学財団（0855890）、そしてジェームズS.マクダネル財団によってサポートされています。</p

1。パターニングに使用される金型の作成<ol><li>パターンの概念設計。パターンは、コントロール細胞接触を細胞のネットワークを形成する細胞を単離、自然な構造を模倣、またはその他の細胞接着及び配置を導くために用意されて作成されます。 </li><li>フォトマスクのパターンと創造のコンピュータ支援設計またはCADベースの作成。所望のパターンは、AutoCADなどのCADソフトウェアで設計されているし、フォトマスクを製造するために外部の会社に送信されます。 </li><li>マスターパターンを生成するためにフォトリソグラフィー。ガラススライドのいずれかに抵抗薄い正または作成される構造体のサイズに応じて、レジスト厚さの負でパターン化されています。ガラスのスライドは、低コストであることの彼らの利益のために使用されるシリコンウェーハよりも強いと壊れたときに限り埃を生産されていません。また、このような回折格子のような他の便利な構造は、マスターのパターンとして使用することができます。 </li><li>パターン化されたスライドは、パターン化されていないスライドのスタックに付加されます。すべてのステップは、粉塵を最小限に抑えるためにクリーンな流フード内で実行されます。 </li><li>マスター金型の作成。スライドのスタックよりも少し大きいアルミホイルの容器は、初期の金型を作成するためにフォトリソグラフィによりパターン化表面の上に注がれているポリジメチルシロキサンを30g（PDMS）を保持するために作成されます。 PDMSを脱気し、1〜2日間硬化させています。 </li><li>一度硬化PDMSは、マスターパターンから剥離し、次のステップのための金型を形成する。 </li><li> 6 2部のエポキシ（gのDevConの＃14310（6 g）を1分間混合し、マスター金型に流し込み、脱気し、硬化させている。エポキシ樹脂を脱気は、多くの気泡破壊のサイクルを使用して（&lt;8分）をすばやく行う必要がありますとその前にのみ薄層を用いたエポキシセットと気泡除去は、気泡を除去することは不可能になります。使用さ6グラムは、迅速な気泡除去を容易に薄層を生成する。 </li><li>一時間後に、2つの部分のエポキシは、部分的に硬化され、より多くのエポキシは後半の手順で処理するeaserである厚い構造を生成するために脱ガスすることなく上に追加することができます。エポキシは、その後1〜2日間硬化させています。 </li><li>一度硬化、エポキシは、PDMSのマスターモールドとテープが容器を形成するエポキシモールドの周りにラップされてから削除されます。作業金型は、その後、エポキシモールドの上にPDMSを流し込みPDMSを脱気し、1〜2日間硬化させることによって作成されます。 </li><li>一度硬化、作業金型は、エポキシ樹脂から剥離し、清浄度を維持するために格納されています。 </li></ol> 2。セルの指導のための金型表面のパターニング<ol><li>作業金型の小さなセクションを切り出し、ポリスチレンペトリ皿の上に配置されます。これらの型のセクションの位置が表示されています。 </li><li>三脚は、小さなセクションから形成され、作業をカビやペトリ皿の表面との間のコンフォーマル接触を確実にするために重み付けされます。良い配置は、皿の底を見ることで観察することができます。 </li><li>アセンブリは、プラズマチャンバ内に配置されます。プラズマ処理は、空気プラズマを用いて10分間29.6 W（最大電力）で150 Paに開始し、継続しています。 </li><li>プラズマ処理した後、金型と体重の罪状認否が削除されます。 </li><li>ペトリ皿は、バイオセーフティキャビネット内の殺菌の10分間UV光下に置き、細胞を接種するまでそこに格納されています。 </li></ol> 3。細胞と表面のシーディング<ol><li> SH - SY5Y CRL - 2266ヒト神経芽細胞腫または他の細胞は、細胞型のための標準プロトコルを用いて培養されています。 </li><li> SH - SY5Yの合流点は、CRL - 2266ヒト神経芽細胞腫細胞はパターン化された表面に播種する前に視覚的に測定されます。 </li><li>標準のセル分割は、それらのペトリ皿の表面から細胞を除去するために行われる。 </li><li>細胞、一度フリーフロートは、パターン化表面に置かれたときに所望の合流点を達成するために希釈された後、パターニングされたペトリ皿の表面に播種されています。 </li><li>細胞が定着し、表面への接続を許可されています。 </li><li>細胞がプラズマによって作成されたパターンに組み立てながら、パターニングされたペトリ皿は、数日間に数時間インキュベートする。 </li><li>培養神経芽細胞、レチノイン酸（10μM）は、ニューロンのような状態に分化する細胞を誘導するために毎日追加されている場合。レチノイン酸の添加は、暗闇の中で行われます。 </li><li>レチノイン酸は、分化が観察されるまで、数日間毎日追加されている。 </li><li>メディアは、3〜4日ごとに置換されます。 </li></ol> 4。観測と解析<ol><li>生細胞またはビデオの定期的な画像が時間をかけて細胞の挙動を観察するために取られる。ライブ画像の場合、細胞は37細胞を保持する顕微鏡ステージトップインキュベーター° C、湿度100％、および5％CO 2で配置されます。細胞はまた、蛍光下で観察するために固定して染色することができます</li><l私捕捉された細胞の&gt;画像や動画を画像解析システム、測定ごとにインポートされるは、成長率、セルサイズ、移動速度、分化、整列、特定のタンパク質の位置、およびその他を含む実施されています。 </li></ol> 5。代表的な結果： プラズマのリソグラフィ技術を実装するの典型的な結果は、いくつかの任意のまたは自然な構造に似た細胞のパターンの形成である。これは、ニューロンのラインとのネットワークが作成されている図1A - Bに見られる。だけでなく、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）とグリッドを形成するC2C12骨格筋細胞を示す図1c - dは 、に見られるような他の細胞型を使用することができます。ポリ- L -リジンのような材料も、特定の細胞型のや他の用途に添付ファイルを容易にするために、 図1eをパターン化することができます。示すように、ニューロンの場合には、どのように作成されたことは、それらの間の接続を持っている細胞のネットワークです。これは、神経細胞が脳の動作に影響を与える隣接セル間の離散の接続を持っている脳の中で自然発生するものが複製されます。ラボのような構造の作成と、接続の数、位置、周波数やその他の要因は系統的に制御することができます。これらarraignmentsの結果が視覚的に測定することができ、そのような化学的又は電気的刺激などの追加入力は、ネットワークの挙動を調べるために実装することができます。 否定的な結果が生い茂ったまたは不完全なパターンや汚染されたサンプルとなります。不完全または草に覆われたパターンは、細胞の理想的な量のパターンを供給しないというどちらか少なすぎるか多すぎる細胞と基質を播種したために発生します。パターンが正しく設計されていない場合、また、（例えば、線狭すぎる）細胞が添付してそれで正常に成長することができなくなります。プラズマのパターニングにも基板を殺菌しているという事実のために適切な細胞培養のプロトコルに従う場合、これはまれですが汚染されたサンプルの場合には、適切な清浄度は、手順のいずれかの間に維持されなかったであろう。 <img src="/files/ftp_upload/3115/3115fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。細胞と蛋白質のパターニング。

<ol>
	<li>Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Guided+Self-Assembly+of+Colloidal+Quantum+Dots+Using+Plasma+Lithography.">Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography.</a> Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).</li><li>Junkin, M., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cell+migration+in+confined+environments+by+plasma+lithography.">Probing cell migration in confined environments by plasma lithography.</a> Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).</li><li>Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. 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利害の衝突は宣言されません。

ここで提示細胞の調査の方法は、だけでなく、生物学的構造を模倣してグループ化された細胞の行動と環境要因への単一の細胞応答の両方の調査を促進する自然の中で細胞内な刺激を生成する方法を提供する多細胞ネットワークの複雑なパターンを作成することができます。それはすぐに細胞培養と同じラボで低コストの機器で実行できるので、このメソッドの使用は、シンプルでありながら堅牢です。それは、また強く細胞の区別があります結果の動作の簡単な観察を可能にし、長期的な細胞の挙動の調査を可能に長期間、安定して自然のことです。それは、さらにそれが多くの細胞タイプと互換性があり、任意のパターンを作成できるように、実行する実験の多様な範囲を可能にする。技術の長期安定性は、プラズマによって与え表面機能が表面の一部であり、削除または劣化することができるコーティングまたは他の層ではないという事実に由来する。液体の下で保管した場合は、変更のこのタイプは、数ヶ月のため、そのセルの指導力を保持することができます。 意味のある結果を確保するために必要な実験の最も重要な部分は、最終的に細胞の指針として使用されるマスターパターンを作成することです。このパターンが適切に設計されていない場合は、細胞が適切にパターンに応答しなくなりますし、有用な動作を得られないことがあります。このような線幅、パターン間隔、および他のようなパラメータが大幅に特定のパターンを持つセルの互換性に影響を与えることができ、通常はそのようなパラメータの範囲は、最も適切な設計のための画面への最初のフォトマスク上に作成することができます。 パターニングを行うに関連する他の重要なパラメータは、ホコリのない環境、細胞播種と細胞培養の一般的な無菌性を維持し、金型の作成が含まれています。金型の作成は、PDMSは、エポキシモールドをオフにキャスト繰り返しを可能にするために行われている様々な転送手順によって行うことができる。繰り返し鋳造の下に小さく、高アスペクト比構造を持つモールドをレジストとしては、同じように劣化しないので、エポキシモールドが作成されます。トランスファー成形が適切に行われた場合、寸法および収量には影響しませんが不完全に脱気、不完全硬化、または過度の加熱によりそのように正しく行わ場合は、パターンの泡、粗さや変形が最終結果に影響を与える発生する可能性があります。ほこりが作業PDMSモールドと表面、したがって適切なプラズマ遮蔽と化学のパターン間の適切な接触を妨げることができるようにホコリのない環境を維持することに関連して、金型は、可能な限りクリーンに保つ必要があります。細胞の播種密​​度は、どちらも少なすぎるまたは多すぎる細胞がパターンのエリアに生息することを保証するために最適化されていなければなりませんし、無菌性は、使用されている細胞の細菌および他の汚染を避けるために維持されなければならない。 技術はまた、マイクロ流体、微小電極、および機械的プローブとして他の要素と組み込むことができます。これは、これらの組み合わせの効果を研究に焦点を当てているより良い実験と今後の作業中にさまざまな生理的条件を複製するために細胞に追加の刺激を提供する

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>プラズマクリーナー、真空チャンバ</td><td> Harrickプラズマ</td><td> PDC - 001 </td><td></td></tr><tr><td>倒立型蛍光および位相差顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> TE2000 - U </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ステージトップインキュベーター</td><td> AmScope </td><td>モデルTCS - 100 </td><td>適切な大気を供給する筐体を含むように修正</td></tr><tr><td>ポリスチレンペトリ皿</td><td> VWR </td><td> 25384-090 </td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン（PDMS） </td><td>ダウコーニング</td><td> Sylgard 184 </td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td> DevConの</td><td> 2トン透明エポキシ＃14310 </td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>様々な</td><td></td><td>メディアは、セル型の標準処方に従って</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>シグマ</td><td> R2625 </td><td></td></tr></tbody></table>

plasma lithography surface patterning for creation of cell networks

マイクロおよびナノスケールの分解能で細胞の微小環境の体系的な操作は、しばしば種々の細胞および分子の現象を解読するために必要です。この要件に対処するために、我々は100nmからミリメートルまでのフィーチャサイズでパターン化表面を作成することにより、細胞の微小環境を操作するためにプラズマのリソグラフィ技術を開発した。この技法の目的は、制御された方法で、個々の細胞だけでなく、細胞とそれらの相互作用のグループの行動を研究できるようにすることです。 このプラズマのリソグラフィ法は、物理的な金型と低温プラズマの接触を遮蔽による基板上の表面化学の選択的修飾に基づいています。この選択的なシールドは、細胞接着と運動を導くことができる化学物質のパターンを残します。このパターン、または表面のテンプレートは、その後の構造自然界に見られることを模倣し、実験調査のための制御可能な環境を作り出すことができる細胞のネットワークを作成するために使用することができます。それは生体適合性の方法で透明な高分子基板上に安定した表面のパターンを生成するように技術はよく生物学的現象を研究するのに適しています。数週間から数カ月の間の最後と表面のパターンは、このようにこのような分化や適応などの長期的な細胞プロセス、の研究を容易に長い期間のための細胞との相互作用を導くことができる。表面の改質は、自然の中で主に化学物質であり、したがって結果の解釈のための地形や物理的干渉を導入していません。また、パターン形成を達成するためにどんな過酷なまたは有害物質を含んでおり、組織培養のために互換性がありますされません。さらに、それは理想的ですし、広く生物学的用途で使用されているそれらのプロパティを調整することができることによるポリマー基板、様々なタイプを変更するために適用することができます。このような移行、接着、またはバインディングなど、特定のプロセスの分離は、マルチセルレベルにシングルで離散的な、明確な観測を可能にするように達成可能な解像度は、また有益である。 このメソッドは、マイグレーション、シグナリング、組織形成、および動作を伴う調査のために、異なる細胞タイプの多様なネットワークを形成するために採用されており、神経細胞の相互作用は、ネットワークにarraigned。

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Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

汎用性の高いプラズマのリソグラフィ技術は、細胞付着を導くための安定した表面のパターンを生成するために開発されました。この手法は、自然の組織を模倣する、いくつかの、異なる細胞タイプを研究するために使用されているものを含め、携帯ネットワークを作成するために適用することができます。

細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.6K ビュー.  University of Arizona. 汎用性の高いプラズマのリソグラフィ技術は、細胞付着を導くための安定した表面のパターンを生成するために開発されました。この手法は、自然の組織を模倣する、いくつかの、異なる細胞タイプを研究するために使用されているものを含め、携帯ネットワークを作成するために適用することができます。

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Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

生物工学

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

細胞培養アプリケーションのためのヒドロゲルの光媒介形成とパターニング

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass substrate, that precisely controls the generation of tandem bubbles and individual cells patterned nearby with well-defined locations and shapes. We then demonstrate the generation of tandem bubbles by using two pulsed lasers illuminating a pair of gold dots with a few-microsecond time delay. We visualize the bubble-bubble interaction and jet formation by high-speed imaging and characterize the resultant flow field using particle image velocimetry (PIV). Finally, we present some applications of this technique for single cell analysis, including cell membrane poration with macromolecule uptake, localized membrane deformation determined by the displacements of attached integrin-binding beads, and intracellular calcium response from ratiometric imaging. Our results show that a fast and directional jetting flow is produced by the tandem bubble interaction, which can impose a highly localized shear stress on the surface of a cell grown in close proximity. Furthermore, different bioeffects can be induced by altering the strength of the jetting flow by adjusting the standoff distance from the cell to the tandem bubbles.

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&amp;#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A microfluidic chip was fabricated to produce pairs of gold dots for tandem bubble generation and fibronectin-coated islands for single-cell patterning nearby. The resultant flow field was characterized by particle image velocimetry and was employed to study various bioeffects, including cell membrane poration, membrane deformation, and intracellular calcium response.

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving (SSLE) of Glass Crystals

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data sets of patient or specimen anatomy in clinical or preclinical settings. However, the use of a virtual, on-screen display limits the ability of these tomographic images to fully convey the anatomical information embedded within. One solution is to interface a biomedical imaging data set with 3D printing technology to generate a physical replica. Here we detail a complementary method to visualize tomographic imaging data with a hand-held model: Sub Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. SSLE offers several unique benefits including: the facile ability to include anatomical labels, as well as a scale bar; streamlined multipart assembly of complex structures in one medium; high resolution in the X, Y, and Z planes; and semi-transparent shells for visualization of internal anatomical substructures. Here we demonstrate the process of SSLE with CT data sets derived from pre-clinical and clinical sources. This protocol will serve as a powerful and inexpensive new tool with which to visualize complex anatomical structures for scientists and students in a number of educational and research settings.

Scaled Anatomical Model Creation of Biomedical Tomographic Imaging Data and Associated Labels for Subsequent Sub-surface Laser Engraving SSLE of Glass Crystals

A methodology is described herein for representing anatomical imaging data within crystals. We create scaled three-dimensional models of biomedical imaging data for use in Sub-Surface Laser Engraving (SSLE) of crystal glass. This tool offers a useful complement to computational display or three-dimensionally printed models used within clinical or educational settings.

ガラスの結晶の次のサブ表面レーザー彫刻のための生物医学断層画像データと関連するラベルのスケーリングされた解剖モデルの作成（SSLE）

Biomedical imaging modalities like computed tomography (CT) and magnetic resonance (MR) provide excellent platforms for collecting three-dimensional data ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...