Bu yöntem, biyofilm büyümesini ve geliştirme sırasında davranışsal özellikleri etkileyen temel çevre koşullarının nasıl belirleneceği gibi biyofilm gelişimi ile ilgili temel soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, çok kanallı, mikro-akışkan plakalar, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar hızlı elde etmek için izin olmasıdır. Bu yöntem biyofilm yapısı hakkında bilgi sağlasa da antibiyotik tedavileri ve biyoremediasyon çalışmalarında da uygulanabilir.
Genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek, çünkü protokol detaylarına dikkat ve titiz beceriler, ihtiyaç vardır. Cihazın yazılıma bağlanmasında bir hata olmasını önlemek için önce PC iş istasyonunu açın ve ardından floresan modülü açın. Floresan deklanşörün anın dadiğinden emin olun ve donanım denetleyicilerini açın.
Ardından, görüntüleme sistemi denetleyicisini ve CCD kamerayı açın. O zaman görüntüleme istasyonunu aç. Tüm ekipman hazır olduğunda, kontrol uygulamasını başlatın ve plakanın yan tarafındaki etikette bulunan plaka numarasını girin.
Astarlama için, önce 48 iyi mikro-akışkan plakayı plakanın altındaki cam yüzeye dokunmadan ambalajından çıkarın ve plakanın altındaki cam kaydırağı mercek dokusuyla temizleyin. Mikro-akışkan kanalları astarlamak için, pipet 200 mikrolitre 37 santigrat santigrat minimum orta çıkış içine, kabarcıklar önlemek için dikkat. Daha sonra plakayı plaka aşamasına yerleştirin.
Etanol kuruduktan sonra plaka aşamasına mühürleyerek, etanol ile arayüzü silin. Kontrol modülündeki manuel modda, sıvıyı Luria-Bertani suyu olarak 37 santigrat derece, maksimum da santimetre kare başına beş dym olarak ayarlayın. Çıkıştan giriş kuyuya giden akışı etkinleştirmek, kanalları astarlamak için çıkış kuyularını tıklatın.
Beş dakika sonra, tohumlama için hazırlamak için akışı duraklatın ve dikkatle sahneden plaka kaldırın. Daha sonra, mikro-akışkan kanallara yol açan iç daire herhangi bir orta çıkarmadan çıkış iyi herhangi bir artık orta aspire. Deneysel kanalları tohumlamak için, giriş kuyusu içine minimum orta 300 mikrolitre ekleyin, bakteri kültürü 300 mikrolitre eklenmesi takip, çıkış kuyusu içine.
Plakayı görüntüleme aşamasına getirerek, plakaya yerleştirmeden önce arayüzü etanolle silmeyi ve tek bir kanala odaklanmak için canlı kamera yayınını kullanın. Canlı yayını görsel olarak izlerken, yaklaşık 2 ila 4 saniye boyunca santimetre kare başına 1-2 dym'lik akışa devam edin, hücrelerin serpantin kanallarına değil deneysel kanala girmesine izin verin ve hücrelerin bağlanmasını sağlamak için plakayı sıcaklık kontrollü sahnede bir saat bekletin. Ek süresinin sonunda, plakayı sahneden dikkatlice çıkarın ve kanalı bozmadan bakterileri çıkış kuyularından aspire edin.
Daha sonra, giriş kuyularından orta kaldırmak için yeni bir pipet ucu kullanın. Yazılımda, mikroskop görüntü edinimi kontrol etmek için birden fazla boyutlu edinimi açın ve zaman atlamasını, birden çok aşamalı pozisyonu ve birden çok dalga boyu seçin. Kaydetme sekmesinde, dosya varsa incroments taban adının denetlendirilediğinden emin olmak için basit bir temel ad oluşturun.
Açıklamaya deneyin tüm önemli ayrıntılarını ekleyin. Zaman atlama sekmesi altında tüm dosyaların kaydedilen klasörü seçmek, deneme süresinin süresini 24 saate ayarlamak ve deneme boyunca her beş dakikada bir görüntü elde etmek için zaman aralığını ayarlamak için seç dizini seçin. Plakaya kazınmış kanal numaralarının üstünde veya altında yer alan kanalın merkezine odaklanarak sahne pozisyonlarını ayarlamak için canlı kamera yayınını ve 10x hedefini kullanın.
20x hedefine geçin ve kanal içindeki en uygun görüntüleme alanını ve odak düzlemini bulun. Ardından, yeni ayarlarla birlikte sahne konumunu listeye ekleyin. Dalga boyları menüsü altında, dalga boylarının sayısını 3'e ayarlayın ve ilk dalga boyunu FITC %100 kameraya ayarlayın, on milisaniyelik pozlama süresiyle, brightfield'a ikinci dalga boyu %50 görünür, en az 3 milisaniye pozlama süresi yle ve üçüncü dalga boyu tüm kapalı, böylece satın alma süreleri arasında son kanalda ışık kalmaz.
AutoRun'u düzenle menüsünde, protokol kurulum sekmesini açın ve uygun deneysel kesme hızında ileri yönde ayarlanan akışla 24 saatlik bir süreyle yeni bir protokol ayarlayın. Protokolü kaydetmek ve sıra kurulum sekmesini açmak için ekle ve kaydet'i tıklatın. Yeni bir dizi ayarlamak için, luria-Bertani et suyu 37 derece, tüm kanallar için varsayılan sıvı olarak seçin.
1 ile 12 arasında kanallar için adım yineleme 1 altında, ilk deneme kesme oranı ile protokolü seçin ve tüm kanalları etkinleştirin. 13 ile 24 arası kanallar için, ikinci deneme kesme oranıyla protokolü seçin ve tüm kanalları etkinleştirin. Ardından Sırayı kaydetmek ve AutoRun için kullanılacak kayıtlı sırayı seçmek için AutoRun menüsünü açmak için Uygula ve Kaydet'i seçin.
Zamanlanmış büyüme biyofilm deneyini ayarlamak için, mikro akışkan plakanın giriş kuyununa 1300 mikrolitreye kadar steril minimal ortam ekleyin ve plakayı görüntüleme aşamasına geri döndürün. Sonra, etanol ile arayüzü silin ve plaka mühür. Protokollerin ve dizilerin doğru şekilde ayarlanıp ayarlandırı.
AutoRun'u başlatmak için başlat'ı seçin ve mikroskop görüntü koleksiyonunu başlatmak için hemen satın alın'ı tıklatın. İlk görüntü edinmenin sonunda, duraklat'ı tıklatın ve brightfield dalga boyunda canlı görüntü modunu seçin. Her aşama konumunu görüntülemek için git'i seçin ve yeni ayarları ayarlamak için geçerliye ayarla'yı seçin.
Ardından, bir sonraki zamanlanmış edinme başlamadan önce devam'ı tıklatın. Bu temsili zamanlı biyofilm büyüme deneyinde, biyofilm kapsamı veya yüzde eşik yüzey alanı, her üç kesme ayarı için farklıydı, bu da makasın biyofilm yüzey kapsamı üzerinde doğrudan bir etkisi olduğunu gösteriyordu. Biyofilm birikiminin toplam göreceli ölçümü, zamanın bir fonksiyonu olarak artmış, büyüme hızı en yüksek kesme stresinden en düşük kesme stresine kadar azalmaktadır.
Her koşulda, nicel büyüme hızının hesaplanabileceği açık bir üstel büyüme dönemi de vardı. Genel olarak, pürüzlülük katsayısı tüm kesme koşullarında zaman içinde azalmış, biyofilm yüzeyleri tüm pürüzsüz hale geldiğini gösteren. Ancak, en düşük kesme yle karşılaştırıldığında, daha yüksek kesme ayarları zaman içinde daha yumuşak bir yüzeyle sonuçlanır ve bu da daha hızlı bir kesme akışının daha yumuşak ve daha düzgün bir yüzeye katkıda bulunduğunu gösterir.
Ayrıca, dokusal entropi, ya da morfolojide rasgelelik, tüm kesme koşulları için zaman içinde artmıştır. Bu yordamı gerçekleştirirken belirtilen sırayı izlemeyi ve her adımı tam olarak gerçekleştirmek için zaman ayırın hatırlamak önemlidir. Gerekli becerileri ustalaşmak için birkaç çalışır alabilir.
Bu prosedürü takiben, HBLC veya GCMS gibi diğer yöntemler, tüketilen glikoz gibi substraights konsantrasyonları hakkında ek soruları cevaplamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, biyofilm alanındaki araştırmacıların kontrollü deneysel koşullar ve hidroterapi örneklemesi ile genel akış ortamlarını gerçek zamanlı olarak keşfetmelerinin önünü açmıştır. BSL2 bakteri suşları ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipman takmak ve uygun atık protokolleri kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
