腫瘍微小環境の研究は、その複雑さのために困難です。我々は、腫瘍細胞型の主要な要因を同定することを可能にする単純な組み合わせ微小環境からなる微小環境マイクロアレイを開発した。MEMA プラットフォームの主な利点は、マイクロ環境条件がすべて定義されているため、関心のあるフェノタイプを駆動する微小環境要因を識別することが簡単であるということです。
MEMAプラットフォームは、一次細胞株および幹細胞を含む他の非癌系で広く適用可能である。湿ったベンチの仕事をスピードアップし、プロトコルを簡素化するために開発したエンジニアリングのトリックとステップの数があります。まず、タッチピンプリンタを使用して、受託者スポットの細胞外マトリックス印刷混合物を8ウェルプレートに印刷します。
直径350マイクロメートルのピンを4回7回のプリントヘッド構成に配置して、微小環境マイクロアレイ用の細胞外マトリックスを印刷します。コラーゲンブロックは、グリッドとしてMEMに印刷されます。PBS充填されたウェルは、細胞外マトリックス印刷混合物ソースプレートの乾燥を防ぐために余分な湿度を提供します。
8 ウェルプレートに配列を 20 列ずつ 35 行で印刷し、合計 700 個のスポットを印刷します。印刷後は、使用前に少なくとも3日間デシケータにプレートを保管してください。まず、多くのMEMAプレートの処理を一度に行うことができるように、4つの間隔のチップを持つマルチチャンネルピペットの使用を可能にする間隔を持つ96ウェルプレートレイアウトを設計します。
次に、冷凍庫からリガンドを取り出し、層流フードの氷で解凍します。各チューブを簡単にフリックしてスピンダウンします。メーカーの推奨バッファを使用して、リガンドを200倍の作業在庫に希釈します。
ピペット10マイクロリットルの各200回のリガンドストックは、96ウェルプレート内の対応するウェルに入った。シールフィルムを使用してプレートを密封し、マイナス20度で保管してください。リガンド処理プレートをバッチで作成し、下流分析用のすべてのメタデータをキャプチャします。
細胞を培養する前に、非汚汚ブロックバッファーのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを20分間ブロックします。2つのパスツールピペットを備えたYスプリッターを使用して、ブロッキングバッファーを一度に複数のウェルに吸い込み、PBSで3倍に洗浄します。乾燥を防ぐために、細胞めっきの準備ができるまで、PBSの最終容積を井戸に残します。
完全なMEMA実験の前に、細胞滴定実験を行うことによりMCF7細胞の播種濃度を最適化する。理想的なスポットは、ここに示すように、データを抽出するのに十分なセル番号を持っていますが、スポットが過度にコンフルエントであるほど多くはありません。MEMAでは、残りのPBSを吸引し、2ミリリットルの播種培地で30,000〜35,000個の細胞を1ウェルで播種する。
MEMAを摂氏37度のインキュベーターに入れる。インキュベーターで一晩接着した後、培地を吸引し、2ミリリットルの還元成長培地に置き換えて、特定のリガンドの刺激的影響を単離する。その後、氷の上に以前に凍結したリガンド処理プレートを解凍します。
遠心分離機は1分間200回gでプレートを解凍した。MEMA培養板の各ウェルからリガンド処理板の適切なウェルに培地200マイクロリットルを移す。ピペットを上下にしてリガンドを培地と混合し、この混合物をMEMA培養プレート内の適切なウェルに戻します。
軽く手で揺れ、MEMAプレートをインキュベーターに戻し、リガンドとECMの組み合わせを摂氏37度と5%の二酸化炭素で培養する。71時間後、MEMAウェルに100回EdUを加え、10マイクロモルの最終濃度を求めます。摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに1時間インキュベートします。
最終インキュベーションの後、井戸を吸引する。室温で15分間2%PFAのウェルあたり2ミリリットルでMEMAsを固定します。その後、井戸からPFAを吸引します。
15分間0.1%の非イオン性界面活性剤のウェルあたり2ミリリットルで透過化する。界面活性剤を吸引し、次いでPBSとPBS-Tの2ミリリットルでウェルを順次洗浄する。その後、各ウェルに1.5ミリリットルのEdU検出反応試薬を加えます。
室温で1時間インキュベートし、揺れ、光から保護します。その後、1.5ミリリットルの市販のクエンチバッファーを使用して反応を焼き付けます。再度吸い込み、最適化された濃度の汚れまたは抗体でインキュベートする前にPBS-Tで洗浄します。
MEMAウェルを染色バッファーの一次抗体でインキュベートし、一晩で摂氏4度で揺れます。一次抗体インキュベーションに続いて、PBSでウェルを洗浄し、続いてPBS-Tを洗浄する。2次抗体を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムのDAPIに添加し、染色バッファーで希釈します。
インキュベート、暗闇の中で室温で1時間揺れる。PBSの井戸あたり2ミリリットルで井戸を2回洗い、PBSの最後の2ミリリットルに残します。画像染色MEMAに、適切な蛍光検出チャネルを備えた自動イメージングシステムの顕微鏡ステージに配置します。
結果の画像データを画像管理システムに出力します。セルをセグメント化し、CellProfiler を使用して強度レベルを計算します。このプロトコルでは、ビン分割されたDAPI強度値のセルサイクルプロファイルと1つの8ウェルプレートからのセルカウントは、G1とG2細胞周期期の細胞を示す。
これは、初期の増殖期の細胞内の2つのnDNA含有量と、有糸分裂を起間させる細胞内の4つのnDNA含有量に相当する。リガンドとECMの微小環境が細胞数とEdUの組み込みの両方に及ぼす影響を示す。赤はセル番号が高いことを示し、青はセル番号の低さです。
ECM条件が細胞数またはEdU陽性に強く影響を与えなかったことを示す効果の多くは、リガンド駆動である。Natagen 1は、このECM分子の存在がMCF7の細胞結合および増殖を阻害するので、明確な例外である。FGF6やノイレグリン-1アルファなどのリガンドは細胞数を高め、EdUの取り込みの割合が高く、アンファイヤグリンやノイレグリン-1 SMDFなどのリガンドは細胞結合および細胞増殖を阻害します。
ニューレグリン-1αで処理されたMEMAスポット上で増殖するMCF7細胞の一例は、ピンク核によって示される高いEdUの取り込み率を示す。この画像では、緑色の染色はセルマスク、青はDAPIです。完全なMEMA実験は高価であるため、完全な実験を行う前に、細胞および血清滴定などの最適化ステップを実行することが非常に重要である。
MEMAプラットフォームを用いて目的とする微小環境条件を特定すると、従来の2Dおよび3D細胞培養システムを用いて、特定のリガンドおよび細胞外マトリックスタンパク質をより深く研究することができます。
